진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

1. 효모 세포 프로토콜 효모 세포 배양 및 고정참고: 셀 고정 및 수확은수정과 함께 10,38에서조정됩니다. 설정 1 L 효모 세포 배양 (야생 형 (WT) BY4741은 600 nm (OD600)에서0.05 AU 이하의 시작 광학 밀도를 가진 궤도 셰이커에서 (효모 추출물의 1 % w /v) 펩톤 2% w/v, 덱스트로스(포도당)의 2%w/v, 40 mg/L의 아데닌 황산염(YPD)이 원하는 조건하에서 사용됨(30°C)이 사용된다. 실험). 효모 세포의 액체 현탁액 배양을 펠레팅하기 위한 호환 가능한 로터 및 원심분리기 병으로 미리 접제 원심분리기를 설치합니다. 포도당 기아 실험의 경우, 600nm(OD600)에서0.6-0.8 AU의 광학 밀도가 도달하면 세포에 도달할 수 있으며, 30°C에서 짧은 원심분리, 1분 동안 5,000xg에 도달한다.참고: 성장하는 세포의 OD기록을 유지하고 지수 성장 단계가 관심있는 경우 OD600이 0.6-0.8 AU에 도달할 때까지 세포가 성장하도록 합니다. 펠릿을 즉시 따뜻한(30°C) YP 배지에 재연하여 포도당을 첨가하지 않거나 낮게 함유하고(0.25% w/v)를 첨가하고 궤도 셰이커 인큐베이터에서 30°C에서 10분 동안 배양한다.참고: 미디어 구성은 후속 교차 연결 효율성에 영향을 줄 수 있습니다. 이 프로토콜은 YPD만 사용하여 테스트되었습니다. 기아 실험을 수행할 때 타이밍을 준수하고 절차 간의 지연을 최소화하는 것이 중요합니다. 세포가 준비되면, 깨끗한 분쇄 물 얼음 250g이 들어있는 비커가있는 연기 후드 내부에 얼음 상자를 설정하십시오. 후드 내부에 25mL 스트리펫과 갓 구입한 메탄올 안정화 37%를 v 포름알데히드 솔루션에 액세스할 수 있도록 하십시오. 분쇄 된 물 얼음의 25 % w / v를 포함하는 비커에 1 L 문화를 붓습니다.참고: 달리 명시되지 않는 한 세포가 얼어 붙을 때까지 모든 후속 작업 전반에 걸쳐 세포를 얼음 위에 보관하십시오. 포름알데히드 용액의 37%를 37%로 넣고 최종 농도2.2%를 v로 추가하고 얼음이 녹을 때까지 혼합물을 강렬하게 저어줍니다. 얼음이 녹으면 타이머를 10분 동안 설정합니다.참고: 재현 가능한 고정 결과를 달성하기 위해 권장 되는 타이밍 및 온도 처방을 준수 합니다. 10분 동안 배양한 후, 미리 냉각된 원심분리기 병으로 배양을 옮기고 세포를 원심분리에 의해 5분 동안 5,000 x g로 전달한다. 이 스핀이 켜지는 동안 50mL 튜브를 미리 식히고 새로 준비된 버퍼 A(글리신을 함유하여 남은 포름알데히드를 중화)에 보관합니다.참고: 제공된 테이블을 참조하여 정확한 버퍼 컴포지션에 대해 대합니다. 원심분리 후 원심분리관을 얼음 위에 놓고 펠릿 쪽을 얼음과 접촉합니다. 튜브를 연기 후드에 넣고 상체를 포름알데히드 폐기물 용기에 넣습니다. 25mL 스트립을 사용하여 모든 튜브에서 모든 튜브에서 셀 펠릿을 20mL의 버퍼 A로 다시 중단하고 50mL 튜브로 이송합니다.참고: 이 세척은 되돌릴 수 없는 교차 연결을 피하는 데 중요하며 완충제 추가는 세포의 수확시간에서 20분의 시간을 초과해서는 안 됩니다. 버퍼 A로 최대 40mL의 부피를 만들고 4°C에서 원심분리, 5,000 x g에서 5분 동안 세척된 셀을 수집합니다. 상체를 버리고 글리신을 함유하지 않는 버퍼 A1의 40mL에서 세포 펠릿을 회수하여 글리신 오염을 제거한다. 펠릿 세포는 4°C에서 원심분리, 5분 동안 5,000 x g로 다시 원심분리에 의해 세포를 다시 합니다. 버퍼 A1을 한 번 더 반복합니다. 상체를 버리고 세포 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 펠릿으로 튜브의 무게를 측정합니다 (젖은 세포 질량은 세포 배양의 1 L 당 ~ 1 g이어야한다). 효모 세포 중단 및 사이토솔 수집 액체 질소가 있는 알루미늄 호일로 늘어선 폴리스티렌 폼 박스를 약 3cm 깊이로 채웁니다. 상자에 50mL 튜브를 똑바로 놓습니다. 10s용 파이펫팅 및 소용돌이로 완충 A2의 550 μL에서 펠릿(~1g 젖은 세포 질량)을 다시 중단합니다. RNase 억제제의 40 U/μL의 10 μL을 다시 10초 동안 첨가합니다.주의: 액체 질소를 취급할 때 열 절연 장갑과 같은 적절한 보호 장비를 착용하십시오. 액체 질소를 보관하는 데 사용되는 용기가 누출되지 않고 내부튜브 랙이 떠 다니거나 옆으로 떨어지지 않도록 하십시오. 산소 고갈을 피하기 위해 통풍이 잘 되는 지역에서 작업하십시오. 1mL 파이펫을 사용하여, 액체 질소를 포함하는 50 mL 튜브에 세포 현탁액을 드립.참고: 물방울의 응집을 피하기 위해 물방울을 천천히 조심스럽게 수행해야 합니다. 새 물방울을 도입하기 전에 물방울이 얼어 붙는지 확인합니다. 냉동 셀 현탁액을 가진 50mL 튜브를 실온으로 옮기고 액체 질소가 완전히 증발할 때까지 기다립니다. 캡으로 튜브를 밀봉하고 셀 펠릿을 -80 °C에 저장하거나 즉시 더 진행하십시오.주의: 액체 질소가 튜브를 밀봉하기 전에 완전히 증발되었는지 확인합니다. 밀봉된 튜브에 남은 액체 질소는 위험한 압력 축적을 일으킬 수 있습니다. 다음 단계를 준비하기 위해, 드라이 아이스에 1.5 mL 뉴클레아제 없는 튜브와 10mL 스테인레스 스틸 연삭 항아리를 미리 식히십시오. 냉동 셀 서스펜션 액적을 깨끗하고 멸균된 주걱을 사용하여 항아리에 옮기습니다.주의: 분쇄 항아리가 단단히 밀봉되어 있는지 확인하십시오. 연삭 항아리를 액체 질소에 1분 동안 담그면 액체 상이 접합 아래에 남아 있습니다. 1 분 동안 교반에 대한 27 Hz에서 냉동 믹서 밀을 설정합니다.참고: 시료가 처리를 위해 하나의 캐니스터만 필요한 경우에도 항상 분쇄 캐니스터와 동일한 모델 중 하나의 균형을 유지합니다. 믹서 밀에서 밀봉 된 연삭 항아리를 27 Hz에서 1 분 동안 교반하십시오. 이전과 같이 액체 질소로 분쇄 항아리를 다시 냉각하고 믹서 밀에서 1 분 동안 27 Hz에서 흔들어줍니다. 1.5 mL 뉴클레아제 없는 튜브와 함께 드라이 아이스가 들어 있는 얼음 상자에 항아리를 옮길 수 있습니다. 작은 강철 주걱을 사용하여 결과 분말 샘플을 ~100 mg 의 알리쿼트튜브로 옮기고 튜브를 -80 °C에 저장합니다.참고: 다성 침전 프로파일 분석, 시토솔을 번역 및 비번역 된 분수로 분리하고, RNase 소화시 SSU, 리보솜 및 디오이분획으로 번역 된 분획을 추가로 분리하는 실험 당 샘플의 ~600 mg을 사용하는 것이 좋습니다. 시토솔의 비번역 분수로부터 고정(poly) 리보소말 복합체의 분리참고: 이전에 설정된 절차10,38일반적으로 (poly) 리보솜과의 공동 침전을 기반으로 번역 된 RNA를 풍부하게하기 위해 다음과 같은. 번역된 및 비번역된 사이토솔 분획을 분리하는 보다 세련된 접근법이 여기에 도입되어 물질을 침전시키고 나중에 재용해 할 필요가 없습니다.2.5mL 선형 10%-20%w/v 자당 그라데이션을 완충 B로 준비하여 얇은 벽 초원심분리기 튜브(5mL, 13 x 51mm)에서 동결 해동법(43)을 사용합니다.참고: 동결 해동 방법은 서로 의 상단에 선형 회귀 농도와 완충 된 자당 층의 순차적 추가 및 동결에 의해 수행됩니다. 자세한 내용은 보충 표 1을 참조하십시오. 연속 50% w/v 자당 쿠션을 만들려면, 선형 그라데이션에 해빙 및 안정화시, 완충 B의 50% 자당 0.5mL을 완충 B의 50% 자당을 19 G x 1.5″ 바늘 또는 유사한/적합한 치수의 유리 모세관을 사용하여 튜브 의 바닥에 직접 분배합니다. 분배하기 전에, 조심스럽게 천천히 미리 형성 된 자당 그라데이션의 상단에서 아래로 바늘이나 모세관의 끝을 운전, 어떤 방해를 피하기, 튜브 바닥에 도달 할 때까지.참고: 버퍼 B 준비에 대한 지침은 보충 표 1을 참조하십시오. 상단 부분을 제거하거나 버퍼 B에서 자당 10w/v를 더 겹쳐서 그라데이션의 균형을 맞추고 얼음을 차갑게 유지하거나 4°C로 유지합니다.참고: 아래50% 자당 층을 가진 불연속 그라데이션은 튜브 벽에 침전하지 않고 더 높은 침전율을 가진 물질을 수집하는 데 필요합니다. 실온에서 냉동 셀 분말 시료의 ~100 mg을 해동하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 파이펫팅을 통해 150 μL의 버퍼 A2에 섞고, RNase 억제제1U/μL에 추가하고, 10s에 대해 과도한 발포 및 기체 상과 혼합하지 않도록 하여 혼합합니다.참고: 달리 명시되지 않는 한 재질을 얼음 위에 보관하면서 모든 작업을 계속합니다. 4°C에서 튜브를 원심분리하여 세포 이물질을 원심분리하여 5분 동안 13,000 x g를 원심분리하고 새로운 1.5mL 저단백질 결합 튜브에서 명확한 수퍼나티(~150 μL)를 회수합니다. 결과 정제 혼합물을 1.3.3 단계에서 불연속 자당 그라데이션 튜브에 적재하고 신중하게 균형을 맞추십시오. 4°C에서 중간 크기의 스윙 버킷 로터에서 튜브를 초음파 심분리하고 평균 g-force 287,980 x g(k-factor 49)를 1시간 30분 동안 사용합니다. 참고: 이러한 조건은 미리 최적화되어 있다(포스트 초센심분리방향 UV 흡광도 추적 분석 사용) SSUs 및 LS(큰 리보소말 서브유닛) 부분을 상부(10%-20% 자당) 부분에 유지하면서 바닥(폴리)을 농축하는 동안(폴리)-20% 자당 분획(폴리)을 농축하는 동안(폴리)를 유지하였다. 19 G x 1.5″ 바늘이 장착된 새로운 멸균 1 mL 주사기를 사용하여 번역된 사이토솔 분획을 수집합니다. 튜브의 바닥을 볼 수 있도록 안정적인 랙에 5mL 그라데이션을 배치합니다. 튜브 의 상단에서, 그라데이션의 바닥에 바로 바늘을 붙이고 (튜브를 구멍을 뚫지 않고) 부드럽게, 어떤 거품을 만들지 않고, 번역 된 RNA 풀을 포함하는 바닥 용액의 정확히 0.5 mL을 그립니다.참고: 이 단계가 차가운 방에서 수행되고 튜브가 단단히 고정되어 있는지 확인합니다. 그라데이션의 교란을 피하기 위해 전체 0.5mL를 단일 업스트로크 모션으로 그리는 것이 좋습니다. 극심분리성 시 자당 그라데이션의 흡수도 판독에 의한 결과 혼합물에서 SSU, LSU 및 라이터 분획의 (poly) 리보소말 의 존재 및 고갈을 확인한다. 10kDa 컷오프 재생 셀룰로오스 멤브레인을 가진 마이크로 농도 장치에서 초침화를 사용하여 수집된 번역된 RNA 풀을 이전 단계에서 100 μL로 농축한다.참고: 0.5mL의 완충제 1로 마이크로 농도 장치의 멤브레인을 미리 세척하고(그림 2a참조) 및 제조업체에서 권장하는 스핀조건(g)을사용합니다. 또한 버퍼 1로 이전 단계에서 재료를 5배(400 μL 추가)하고 200 μL로 다시 농축하여 자당의 부분 제거뿐만 아니라 더 작은 부피를 허용한다.참고: 결과 혼합물을 최대 6개월 동안 -80°C에 저장하고 TCP-seq 라이브러리 시공의 ‘총 번역 RNA’ RNA-seq 라이브러리 시공 또는 RNase 소화 단계의 입력 재료로 사용하는 것이 좋습니다. ‘번역되지 않은’ 사이토솔 분획은 유사한 절차를 사용하여 그라데이션의 상단에서 회수하고 -80°C에 저장될 수 있다. 고정(poly) 리보솜 복합체의 RNase 소화 및 소화된 물질의 분리를 작은 리보솜 하위 단위(SSU), 모노리보솜(리보솜, RS), 디리보솜(disomes, DS) 분획으로 분리참고: 절차는 일반적으로 이전에 설명한 접근 방식을 따릅니다.10,38그러나 수정된 그라데이션 유형, 분리 시간, 가속 및 RNase 소화 조건이 사용되어 세 개의 격리된 분획 모두에 걸쳐 최상의 해상도를 달성합니다.신중하게 균형 잡힌 12.5 mL 선형 10%-40% w/v 자당 그라데이션13 mL 얇은 벽 폴리 프로필렌 튜브, 14 x 89 mm, 동결 해동법(43)을 사용하여 1.3.1 단계및 그 안에 주의하십시오. 실온에서 해동하고 즉시 얼음에 샘플을 전송하거나 단계 1.3.12에서 농축 및 자당 고갈 된 번역 된 사이토솔 분획을.참고: 달리 명시되지 않는 한 얼음에 대한 모든 절차를 계속하십시오. 번역된 사이토솔 분획을 23°C에서 30분 동안 분획의 1OD260 단위당 대장균 RNase I의 4.5 U에서 혼합하여 소화한다. RNase I를 0.25 U/μL로 유도하여 RNase I를 비활성화하여 RNase I를 비활성화할 수 있는 RNase 억제제를 즉시 추가하고 혼합합니다.참고: RNase I. Derive AU260을 사용하여 AU260을 억제할 수 있는 RNase 억제제(260nm의 흡광도는 μL에서 lysate의 1cm 광학 경로 x 부피에 해당하는 광학 밀도 단위로 표준화) / 1,000을 사용합니다. 즉시 샘플을 얼음으로 옮기습니다.주의: 소화의 권장 조건을 준수 하 고 신중 하 게 추가 된 RNase I의 양을 측정 하는 것이 중요 하다. 여기서 언급된 RNase I 장치는 37°C에서 30분 에서 마우스 간 RNA로부터 산 수용성 물질의 1 μg를 생성하는 데 필요한 효소의 양으로 정의됩니다. 효소 육주가 너무 농축되어 있는 경우, 매우 적은 양의 용액을 피하려면 완충제 1로 희석하는 것이 좋습니다. 반응 혼합물을 1.4.1 단계에서 10%-v 자당 그라데이션에 로드합니다.참고: 그라데이션당 150-300 μL 범위의 최종 볼륨을 사용합니다. 각 정화에는 최소 2개의 그라데이션이 필요합니다. 재료의 다른 입력 볼륨(낮은 AU260,10-11 AU260),DS및 상대적으로 높은 AU260,13-14 AU260,SSU 또는 RS용)을 사용하여 최적의 분리를 달성한다. 3시간 30분 동안 평균 g-force 178,305 x g(k-factor 143.9)로 4°C에서 중간 부피 스윙 버킷 로터에서 튜브를 초원심분리합니다. 주의: 예비 저울 튜브가 필요한 경우 질량 및 질량 분포를 샘플 함유 튜브와 균등화합니다. 균일한 자당 농도가 있는 튜브가 아닌 시료 오버레이에 해당하는 버퍼의 양으로 오버레이된 예비 자당 그라데이션을 사용합니다. 0.2 μm 여과 중추적 용액(예를 들어, 여기에 사용되는 대로 탈온화된 물에 60% 자당)을 기위 펌프에 채우는 것을 포함하여 초원심분리 스핀 이완료 되기 최소 30분 전에 그라데이션 분수장치를 설정한다.참고: 탈이온화된 물을 사용하여 분수기의 선과 튜브를 오염시키고, 그 다음으로 탈온화된 물, 탈온화된 물, 그리고 마지막으로 80% 에탄올이 실행 전후에 탈온화된 물 용액에 의해 뒤따릅니다. 흡수성 판독 기준을 먼저 분해된 물로 채우고 제조업체의 권장 사항에 따라 광학을 제로화한 다음 샘플 튜브와 동일한 버퍼로 만든 14 x 89mm 자당 그라데이션을 사용하여 기준선 시프트를 보정합니다(예: 버퍼 1).참고: 동일한 변위 속도를 사용하여 1.5mL/min과 같은 샘플 판독을 조정할 수 있습니다. 먼저 검출기의 광학 경로를 입력하고 분획 수집기 출력에 처음 나타나는 솔루션 사이의 시간을 정확하게 계산하여 변위 시스템 데드 볼륨을 측정합니다.참고: 권장 속도 1.5mL/min의 분획은 실온에서 수행될 수 있습니다. 수집된 분획을 얼음 위에 즉시 옮기는 것이 좋습니다. 샘플의 예상 퇴적물 위치 및 흡광도 프로파일을 기반으로 254nmMMMMm, 1.5mL/분 변위 속도 및 인라인 분수 검출에서 라이브 흡광도 판독을 사용하여 분획을 수행합니다. 이전에 측정한 대로 죽은 부피에 해당하는 시간 지연으로 컬렉터 튜브 스위칭을 사용합니다. SSU, RS 및 DS 복합체의 위치 및 이동성에 대응하는 분획을 분리하고 새로운 저단백질 결합 1.5 mL 마이크로센트심립후지 튜브로 수집; 격리된 분획을 얼음 에 즉시 옮기고 더 멀리 처리되지 않으면 얼수 있습니다.참고: 수집된 분획을 드라이 아이스 또는 액체 질소로 즉시 플래시 동결하고 -80°C 이하로 최대 6개월 동안 저장하는 것이 좋습니다. RNA-seq 라이브러리를 구축하기 위해 RNA의 리보소말 복합체 및 분리의 분리 교차링크를 차단/반전시키고 관련 단백질로부터 RNA를 분리하기 위해, 전체 자당 그라데이션 분획의 약 절반을 새로운 저핵산 결합 뉴클레아제 1.5 mL 마이크로센트심분리기 튜브(튜브당 350 μL)로 뚜껑/잠금 장치로 이송한다. 100% 정지 용액40μL(10% SDS w/v 및 100m EDTA), 25°C(10mMMMM) 1.6 μL(10mMMM) 및 데이온 핵제40m의 최종 수량에 대한 1.6 μL을 보충한다. 튜브의 내용을 파이펫팅하여 혼합하고 실온에서 튜브를 옮기십시오. 산성 페놀:클로로폼:이소아밀 알코올 125:24:1 (pH 4.0-5.0) 혼합물을 각 튜브에 동일한 부피를 첨가한다. 최대 속도로 설정된 소용돌이 믹서를 사용하여 2 분 동안 혼합물을 격렬하게 흔들어줍니다.주의: 페놀과 클로로폼은 부식성이 있고 독성이 있습니다. 액체와의 물리적 접촉을 피하고 통풍이 잘되는 지역이나 연기 후드 아래에서 작동하십시오. 페놀 또는 클로로폼으로 작업할 때 장갑, 실험실 코트 및 보호 고글 또는 얼굴 보호막을 항상 사용하십시오. 튜브를 열셰이커에 놓고 65°C, 1,400rpm에서 30분 동안 계속 흔들어 줍니다. 실온에서 10 분 동안 12,000 x g에서 혼합물을 원심 분리하여 위상 응집을 용이하게합니다. 상부 수성 상위를 수집하고 신선한 저핵산 결합 1.5 mL 튜브로 옮기.참고: 교차 오염을 방지하려면 수성 단계를 완전히 복구하려고 시도하지 마십시오. 합리적인 회수 부피는 300-350 μL입니다. 수집된 수성 상에 3M 아세테이트(25°C에서 pH 5), 글리코겐 20μg(5 μg/μL 스톡 사용) 및 절대 에탄올 2.5부로 수중 상량을 보충한다. 튜브를 1분 동안 소용돌이로 만들어 용액을 조심스럽게 섞는다. RNA를 2시간 이상 -20°C에서 배양하여 RNA를 침전시한다(하룻밤 권장). 튜브를 실온으로 데우고 소용돌이에 섞습니다.참고: 튜브의 사전 온난화와 실온에서의 후속 원심 분리는 소금과 페놀 의 공동 강수량 및 이월을 줄이는 데 도움이 됩니다. 이러한 조건은 설명된 대로 수행되고 충분히 순수한 에탄올을 사용하는 경우 RNA 수집의 물질적 손실 또는 비효율성을 초래해서는 안 됩니다. 펠릿 RNA는 실온에서 30 분 동안 12,000 x g에서 튜브를 원심분리하여 침전시합니다. 상체를 버리고 80 % v / v 에탄올로 펠릿을 두 번 세척하여 실온에서 10 분 동안 12,000 x g에서 원심 분리로 매번 수집합니다. RNA 펠릿을 튜브 뚜껑을 열고 열린 튜브를 45°C로 10분 동안 설정된 드라이 블록 히터에 배치하여 건조시. 결과 말린 펠릿을 1x HE 버퍼의 20 μL로 녹입니다. UV 흡광도 스펙트럼 측정을 사용하여 결과 RNA 농도를 추정한다.참고: RNA 단편 길이 및 총 량은 자동화된 형광 계 모세관 겔 전기포광 장치와 같은 데니어링 젤-전기포광을 사용하여 더욱 평가될 수 있다. 선택적 SSU 농축의 태그된 eIF 및 서부 블롯 분석에 의한 SSUs의 선택적 공동 면역정화참고: 1.4.11 단계에서 소화 및 퇴적물 분리SSU 분획의 ~15 AU(260nm)를 사용하여 자기 IgG 비드를 사용하여 친화성 정화를 수행한다. SSU 분획의 ~5%를 입력 컨트롤(입력 분획, I)으로 저장합니다. eIF4A 태그(TIF1-TAP; 탠덤 친화성 정화 태그) 효모 균주가 사용되어 안티TAP 항체를 사용하여 TAP 태그에 대한 프로빙을 통해 eIF4A를 검출할 수 있게 하였다.자기 IgG 구슬 현탁액의 100 μL (1 mg의 비드 1 mg은 용사 또는 분수의 각 15 AU (260 nm)에 대해 사용되었으며 새로운 저단백질 결합 1.5 mL 튜브; 마그네틱 랙을 사용하여 구슬을 수집하고 흡인합니다. 마그네틱 랙을 사용하여 파이프팅 및 수집을 통해 순차적인 리서스펜션을 사용하여 1mL의 버퍼 1로 마그네틱 구슬을 두 번 세척합니다. 세탁 후, 수집 및 구슬을 데리고, 자기 랙에 보관합니다. SSU 분획을 세척된 구슬에 추가하고 ~20 rpm에 설정된 사이클로믹서에서 4°C에서 회전하여 4h의 혼합물을 배양한다. 4°C에서 마그네틱 랙을 사용하여 구슬을 수집하고 상체(플로우-스루 분획, FT)를 저장합니다. 4mM DTT로 완충 1로 4°C에서 구슬을 두 번 세척하고, 매번 사이클로믹서에서 10분 간 회전하고 마그네틱 랙의 구슬을 수집하고 디캔딩합니다. 세하(W1 및 W2 분수)를 저장합니다. 서부 블로팅과 같은 분석 적용의 경우, PH 8.5~1x 및 DTT를 2mM로 하는 LDS(리튬 도데실 황산염) 폴리아크릴젤 전기포레시스(PAGE) 샘플 버퍼를 첨가하여 하발된 물질을 분해 및 감소 조건하에서 엘테한다. 혼합물을 95°C에서 열블록에서 5분 동안 가열하여 용출을 마무리합니다. 마그네틱 랙을 사용하여 구슬을 수집하고 신선한 저단백질 결합 1.5mL 마이크로센트심리분리기 튜브에서 변성 용출(E 분수)을 회수한다. 이전 단계에서 E 분획을 사용하여 데니칼 황산나트륨(SDS) PAGE를 즉시 실행하거나 E 분획을 -20°C에 저장한다.참고: 후속 응용 프로그램에 대한 TAP 태그가 풍부한 번역 단지의 사전 복제 컬렉션은 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제를 사용하는 대체 용출 방식을 사용합니다. 자세한 내용은 보충 표 1을 참조하십시오. 희석FT, W1 및 W2 분획을 농축하려면 3배의 얼음 차가운 아세톤을 추가하여 재료를 침전시합니다. 샘플-아세톤 믹스를 -20°C에서 3시간 동안 배양한다. 펠릿은 4°C에서 10분 동안 13,000 x g에서 튜브를 원심분리하여 침전을 유발합니다. 상수와 공기를 폐기하고 30 분 동안 실온에서 열린 튜브의 펠릿을 건조시십시오. 2mM DTT로 보충된 1x LDS 적재 버퍼의 7 μL에 펠릿을 용해하십시오. 샘플을 95°C로 설정된 열 블록에서 5분 동안 가열합니다. 모든 I, FT, W1, W2 및 E 샘플을 아크릴아미드 그라데이션, 비스 트리스 폴리아크릴아미드 데니징 젤의 4%-12%w/v에 로드합니다. 단백질 마커(10-250 kDa)가 잘 해결되고 납 염료가 젤의 바닥에 도달할 때까지 80V에서 완충제를 실행하는 1x MES SDS(2-[N-mopholino]에탄설포닉산, 나트륨 도데킬 황산)을 사용하여 젤을 실행한다.참고: WCL(전체 셀 리사테)(2-10 μg)의 직렬 희석을 대조군으로 젤에 적재하는 것이 좋습니다. 분수 물질에 걸쳐 젤의 유사한 로딩을 달성하기 위해 여러 시도가 걸릴 수 있습니다. 서쪽 블로팅 장비 제조업체가 권장하는 콜드룸에서 100V에서 1h의 습식 이송 방법으로 젤의 단백질 함량을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인에 전달한다. 상온에서 1시간 동안 적절한 차단 버퍼(인산염 완충식식린 기반)를 사용하여 멤브레인을 차단합니다. 항체 희석에 대한 제조업체의 지침에 따라, 태그된 eIF4A 단백질, 안티파반1p 항체 또는 항-β 액틴 항체(또는 기타 바람직한 표적)를 검출하기 위한 항TAP 항체로 멤브레인을 프로브하여 멤브레인 버퍼(PBS)-희석 항체(1:1,000 희석제)를 통해 멤브레인의 하룻밤 에 배양함으로써참고: 1:1,000 항체 희석은 좋은 출발점입니다. 1x 인산염 완충식 식염수로 멤브레인을 세 번 세척하고, 각각 10분 동안 0.2% v/v 트위엔 20(PBST)을 세척한다. 1 시간 동안 실온에서 사이클로믹서에서 배양하여 제조업체의 지시에 따라 형광으로 표시된 이차 항체로 멤브레인을 조사하십시오.참고: 1:20,000 항체 희석은 좋은 출발점입니다. 1x PBST로 멤브레인을 각각 10분 동안 세 번 씻으시다. 바이온화된 물로 멤브레인을 간략하게 헹구고 절대 메탄올로 헹구습니다. 제조업체의 지침에 따라 형광 이미징 시스템에서 멤브레인을 건조하고 시각화합니다.참고: 다른 단백질에 대한 염색은 상이한 형광 채널(eIF4A-TAP 대 β 액틴 쌍과 같이)과 일치하는 염료를 사용하여 동일한 멤브레인을 순차적으로 염색하거나 염색하거나 각 항체를 반복적으로 프로빙하고 각 조각을 각각의 항체로 개별적으로 프로빙함으로써 달성될 수 있다. 2. 포유류 세포 프로토콜 포유류 세포 배양 및 고정 2 T-175 플라스크에서 HEK293 세포를 덜벡코의 수정된 이글 배지에서 60%-70%로, 10% v/v 태아 보빈 세럼은 37°C, 5% v/v 이산화탄소로 성장시킨다.참고: 전체 미디어는 L-글루타민, 페놀 레드 및 중탄산나트륨을 함유하고 있지만 HEPES 또는 피루바테 나트륨을 함유한 500mL의 상업적으로 구입한 DMEM에 상업용 FBS 55mL를 첨가하여 만들어집니다. T-175 플라스크당 셀 카운트는 70%의 합류에 1.7-2.0 x 107의범위에 있어야 한다. 원하는 고정 시간 전에 적어도 3 시간, T-175 플라스크의 미디어를 정밀하게 30mL의 미리 따뜻하게 된 완전한 매체로 대체하고 셀 인큐베이터의 플라스크를 교체한다.참고: 셀 분리를 방지하기 위해 새 용지가 플라스크의 반대쪽에 피펫되어 셀 단층으로 피프트되어 있는지 확인합니다. 최소한의 가스와 온도 균형 장애를 도입하여 가능한 한 빨리 미디어 교환을 수행하려고 시도합니다. 세포 용지가 교체되면 고정에 필요한 버퍼 및 화학 물질을 준비하십시오. DPBS 의 500mL 병에 2.5M 글리신 재고의 10.2 mL을 추가하여 50mM 글리신으로 DPBCo의 인산염 버퍼-살린(DPBS)을 준비하십시오. 비멸 조건에서 사용할 단계 2.1.1과 0.25 % 트립신-EDTA의 100 mL 알리쿼트와 같이 10 % FBS로 보충 된 DMEM 병을 준비하십시오. 염화칼슘(CaCl2)과염화마그네슘(MgCl2)으로미리 제조된 상업용 DPBS를 추가 로 공급한다.참고: 용액은 최대 2주 동안 4°C로 저장할 수 있습니다. T-175 플라스크가 균일하게 상단에 맞게 준비된 버퍼와 함께 연기 후드에 보관할 수 있도록 분쇄된 물 얼음으로 가장자리에 얼음 상자를 준비합니다.참고: 환경 변화에 대한 번역의 신속한 반응으로 인해 인큐베이터에서 셀 플라스크를 제거하고 포름알데히드 솔루션을 추가하는 모든 타이밍을 최소화해야 합니다. 세포를 식히려면 인큐베이터에서 T-175 플라스크를 제거하고 얼음에 단단히 눌러 최대 표면 접촉을 보장합니다. 화학 연기 후드 내부에는 플라스크를 옆으로 기울여 미디어가 세포 반대쪽에서 수집되도록 합니다. 파이펫 168 μL 37% w/v 포름알데히드를 풀로 직접 입력된 매체로 직접 넣습니다(최종 농도0.2%w/v). 플라스크를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 서 플라스크를 밀착하고 얼음 위에 재배치하여 수평이 되고 세포가 균등하게 덮여 있는지 확인합니다.주의: 포름알데히드는 잠재적인 장기 부작용과 호흡기 및 피부 모두에 자극성 물질인 유해한 물질입니다. 그것은 단지 적절한 화학 연기 후드에서 처리해야합니다. 포름알데히드 용기는 연기 후드 밖에서 항상 밀봉해야합니다.참고: 포름알데히드가 플라스크 벽이 아닌 세포 매체에 직접 첨가되었는지 확인합니다. 2.1.6 단계는 1 분 미만이 소요됩니다. 플라스크를 얼음 에 배양하여 10분 더 보간합니다. 세포 반대의 플라스크 측면을 통해 적절한 폐기물 용기에 미디어를 부어 넣습니다. 탈피, 칼슘과 마그네슘 이온없이 덜벡코의 인산염 완충 식염수의 30 mL의 파이펫과 추가로 포함 50 mMM 글리신, 부드럽게 세포 반대쪽에. 플라스크를 흔들어 섞는다. 플라스크를 수평 위치로 되돌리고 얼음에 10분 더 배양합니다. 세포 반대의 플라스크 측을 통해 용액을 붓고 표준 0.25% w/v 트립신-EDTA 용액의 7mL을 부드럽게 추가하여 세포를 분리하고 재보펜합니다. 실온에서 플라스크를 5-10분 동안 배양합니다.참고: 트립신-EDTA 솔루션이 모든 셀을 균등하게 커버하도록 보장합니다. 주기적인 부드러운 기울기와 흔들림을 사용하여 세포 분리를 촉진합니다. 플라스크를 수직으로 재배치하고 스트리펫을 사용하여 플라스크 벽에서 남은 세포를 부드럽게 세척하여 분리 된 세포를 수집합니다. 서스펜션을 얼음 위에 세팅된 50mL 튜브로 옮킨다.참고: 고정 된 세포는 더 깨지기 쉬워질 수 있습니다. 플라스크 벽에서 세포를 분리하는 데 필요한 것보다 강렬하거나 더 많은 파이펫을 피펫하지 마십시오. 수집된 셀 서스펜션을 20mL의 완전한 미디어(10% FBS가 있는 비멸얼음-차가운 미디어)로 즉시 보완하고 튜브를 부드럽게 뒤집어 섞습니다.참고: 전체 세포 배양 배지(10% FBS 포함)가 트립신을 중화하여 세포막및 세포 붕괴에 대한 추가 손상을 방지합니다. 5 분 및 4 °C에 대한 100 x g에서 튜브를 원심 분리하여 세포를 펠렛. 셀 펠릿은 명확하게 표시되어야 합니다. 미디어를 부어 부드럽게 Ca2 +,Mg 2+,글리신없이 얼음 차가운 DPBS의 10 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 2.1.12 단계를 반복합니다. 세척 버퍼를 붓고 부드럽게 얼음에 글리신없이, Ca2 +,Mg2 +,얼음에, 얼음 차가운 DPBS의 800 μL에 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 재중단된 세포를 새로운 저단백질 결합 1.5 mL 마이크로센심분리기 튜브로 전달한다. 3 분 및 4 °C에 대한 100 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 1mL 피펫을 사용하여 상체를 조심스럽게 폐기하십시오. 이 단계에서, 세포 펠릿은 -80°C에서 동결되거나 세포 용해 단계로 진행할 수 있다.참고: 냉동 세포 펠릿은 -80°C에서 최대 1년까지 보관할 수 있습니다. 우리는 세포 펠릿 동결 후속 용해를 용이하게하고 장기 저장이 계획되지 않은 경우에도 동결을 권장한다는 것을 발견했다. 포유류 세포 중단 및 사이토솔 수집 생물 안전 캐비닛에, nonionic, 비덴토 세제및 40 U/μL RNase 억제제의 7 μL을 기반으로 용해 버퍼의 300 μL을 추가합니다. 1 mL 팁을 사용하여 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 조심스럽게 1-3 mL 주사기에 25 G 바늘을 부착하고 격렬하게 혼합물을 피펫, 적어도 일곱 느린 위쪽으로 섭취와 빠른 하향 배기 스트로크를 사용하여. 주사기와 바늘을 날카로운 쓰레기통에 버리고 31 G 바늘이 장착된 0.3 mL 주사기를 사용하여 절차를 반복하십시오. 주사기와 바늘을 날카로운 쓰레기통에 버리십시오. 4°C에서 튜브를 원심분리하고, 12,000 x g에서 5분 동안 세포 이물질을 펠렛합니다. 새로운 저단백질 결합 1.5 mL 마이크로센심분리기 튜브로 상피체를 전달한다. 둘 다, 세포 파편(제어 목적)과 그 결과 -80°C에서 세포 용액을 명확히 한다.참고: 2개의 T-175 플라스크가 결합되고 권장볼륨이 뒤따를 때 lysate 범위는 25-30 AU260 사이입니다. 용액및 세포 파편은 -80°C에서 최대 1년까지 보관할 수 있다. 시토솔의 비번역 분수로부터 고정(poly) 리보소말 복합체의 분리 선형 15%-45% w/v 자당 그라데이션을 13mL 박벽 폴리프로필렌 튜브, 14 x 89mm, 효모 프로토콜의 1.3.1 단계에서 설명한 대로 동결 해동 방법을 사용하지만 버퍼2(도 2a)를사용한다.참고: 분획 전날 밤 4°C의 차가운 방에서 하룻밤 동안 그라데이션을 해동합니다. 이전 단계에서 셀 용해의 150-250(최대 300)의 μL을 균형 잡힌 그라데이션에 로드합니다. 나머지 용액을 -80 °C에 저장하고 제어 목적으로 사용합니다.참고: 여기에 다각형, 리보소말 및 ‘무료’ SSU 분획으로 침전 기반 분리의 예가 제공됩니다. 다른 방법은 제공된 보충 표 1을 참조하십시오. 4°C에서 중간 부피 스윙 버킷 로터에서 튜브를 초원심분리하고, 평균 g-force 178,305 x g(k-factor 143.9)에서 1시간 45분 동안 튜브를 분리한다. 스핀 완료 하기 전에 30 분, 설정 하 고 효 모 프로토콜 단계 1.4.7-1.4.9에 설명 된 대로 그라데이션 분획기를 기준. 효모 프로토콜 단계 1.4.10-1.4.11에 설명된 바와 같이 일반적으로 그라데이션을 분수한다.참고: 이 단계는 다각형, 리보소말 및 ‘무료’ SSU 분획을 분리합니다. 다각형 분획은 다각형 프로파일링 실험에서 사용될 수 있다. 수집된 분획을 얼음 위에 즉시 옮기고 더 이상 처리되지 않으면 최대 6개월까지 -80°C에 보관하십시오.참고: 분획 수집관 변경이 온라인 분수 식별 및 분리와 동기화되는 경우 최대 800μL 분획(1.5mL/분당 분수 당 32분의 수집 시간)을 사용하는 것이 좋습니다. 인라인 흡광도 판독을 사용하지 않고 분획이 수행되는 경우 250-500 μL 분획(분수당 10-20분당 분수 당 1.5mL/분)을 사용하는 것이 좋습니다. 분리 후, 분획은 면역 정화, 전자 현미경 검사법, 소법 페이지 및 서부 블로팅을 즉시 사용하거나 후속 RNA 및/또는 프로테오믹스 분석을 위한 교차 링크 반전을 실시할 수 있다.