Rapid <em>In Vivo</em> Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Yoshika Janapala; Katrina Woodward; Jiwon Lee; Melanie Rug; Thomas Preiss; Nikolay E. Shirokikh

doi:10.3791/62639

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biyoloji

تثبيت سريع في Vivo وعزل المجمعات الترجمية من الخلايا Eukaryotic

Published: December 25, 2021

doi:

10.3791/62639

Yoshika Janapala*¹, Katrina Woodward*¹, Jiwon Lee², Melanie Rug², Thomas Preiss^1,3, Nikolay E. Shirokikh¹

¹Division of Genome Sciences and Cancer, The John Curtin School of Medical Research,The Australian National University, ²Centre for Advanced Microscopy,The Australian National University, ³Victor Chang Cardiac Research Institute

Özet

نحن نقدم تقنية لتحقيق الاستقرار السريع في المجمعات التحويلية (التمثيل الحيوي البروتيني) مع الفورمالديهايد المترابطة في الخميرة الحية وخلايا الثدييات. النهج يتيح تشريح وسيطة عابرة وديناميكية الحمض النووي الريبي: التفاعلات البروتين. يمكن استخدام المجمعات المترابطة في تطبيقات متعددة في المصب مثل طرق التنميط العميق المستندة إلى التسلسل ، والتنظير الدقيق ، وقياس الطيف الكتلي.

Abstract

الاستجابات السريعة التي تنطوي على إعادة توزيع سريع من رسول (م) الجيش الملكي النيبالي والتعديلات من ترجمة مرنا هي ذات الصلة إلى التعديلات المنزلية الجارية من الخلايا. هذه التعديلات حاسمة للبقاء على قيد الحياة الخلايا eukaryotic و “السيطرة على الضرر” خلال مستويات المغذيات والملوحة المتقلبة، ودرجة الحرارة، ومختلف الضغوط الكيميائية والإشعاعية. نظرا للطبيعة الديناميكية للغاية للاستجابات على مستوى الحمض النووي الريبي ، وعدم استقرار العديد من الحمض النووي الريبي: الحمض النووي الريبي والجيش الملكي النيبالي: وسيط البروتين ، فإن الحصول على لقطة ذات مغزى لحالة الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي ممكن فقط مع عدد محدود من الطرق. تعد تجارب التنميط الريبوسومية المستندة إلى الحمض النووي الريبي على نطاق النسخ من بين أكثر مصادر البيانات بالمعلومات للتحكم في الترجمة. ومع ذلك، يمكن أن يؤدي غياب الحمض النووي الريبي الموحد ورنا: استقرار البروتين المتوسط إلى تحيزات مختلفة، لا سيما في مسارات الاستجابة الخلوية سريعة الخطى. في هذه المقالة، ونحن نقدم بروتوكول مفصل من التثبيت السريع المطبق على الخلايا eukaryotic نفاذية مختلفة، للمساعدة في الجيش الملكي النيبالي والجيش الملكي النيبالي:استقرار البروتين المتوسط. كما نقدم أمثلة لعزل RNA المستقرة: مجمعات البروتين على أساس الترسيب المشترك مع الكسور الريبوسومية والبولي (ريبو) السخامية. يمكن استخدام المواد المثبتة المنفصلة لاحقا كجزء من تجارب من نوع التنميط الريبوسومي ، كما هو الحال في نهج تسلسل ملف تعريف مجمع الترجمة (TCP-seq) ومشتقاته. وقد تجلى الآن براعة أساليب TCP-seq على غرار التطبيقات في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية وأنواع الخلايا. ويمكن أيضا أن تكون المجمعات استقرت بالإضافة إلى ذلك تقارب تنقية وتصويرها باستخدام المجهر الإلكتروني، وفصلها إلى كسور مختلفة بولي (ريبو) سومال وتعرض لتسلسل الحمض النووي الريبي، وذلك بسبب سهولة انعكاس الربط العرضي. لذلك ، يمكن أن تكون الطرق القائمة على تثبيت snap-chilling والفورمالديهايد ، تليها الترسيب القائم أو أي نوع آخر من الإثراء المعقد للبروتينات : RNA ، ذات أهمية خاصة في التحقيق في التفاصيل الدقيقة لديناميكيات RNA:protein complex في الخلايا الحية.

Introduction

تخضع الكائنات الحية لتغيرات ديناميكية داخل وخارج الخلية عبر عمرها ، والتي تتطلب استجابات سريعة للحفاظ على التوازن وضمان البقاء على قيد الحياة. للسماح للتكيف البيئي، تضبط الخلايا النواة عملية التمثيل الغذائي الخاصة بها عن طريق التحكم في التعبير الجيني. يمكن ممارسة التحكم في التعبير الجيني أثناء النسخ و / أو الترجمة؛ مع ردود الترجمة تحدث عموما بسرعة أكبر¹^،²^،³^،⁴. على سبيل المثال، عادة ما تنشأ التغيرات التحويلية في غضون 1-30 دقيقة من بداية الإجهاد، في حين أن التعديلات على مستوى النسخ تتبع ساعات بعد التعرض للإجهاد³^و⁴^و⁵. يتم تحقيق التعديلات على إخراج الترجمة بسرعة أكبر بسبب التوافر المستمر لجزيئات الحمض النووي الريبي messenger (m) في السيتوبلازم. على العكس من ذلك ، على مستوى النسخ ، يجب توليف جزيئات مرنا جديدة ، وفي eukaryotes ، معالجتها وتصديرها من النواة ، مما يؤدي إلى تأخيرات واسعة في وقت الاستجابة²^،⁴^،⁶^،⁷^،⁸.

تتميز الاستجابة الترجمية الحادة للإجهاد بشكل عام بانخفاض إجمالي في ناتج الترجمة ، مع التنظيم الانتقائي للبروتينات اللازمة لبقاء الخلية¹^,³^,⁴^,⁹. ويعتقد أن خفض إنتاج البروتين الإنتاج أن تكون حاسمة بسبب ارتفاع نفقات الطاقة لعملية³^,⁷. ولتيسير التثبيط والتنظيم الانتقائيين، تخدم الاستجابات التحويلية مجموعة من الآليات التنظيمية المعقدة. يمكن ممارسة التنظيم عبر جميع مراحل الترجمة: بدء، استطالة، إنهاء التمثيل الحيوي متعدد الببتيد وإعادة التدوير الريبوسومي¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³، ولكن يتم عرضها بقوة في مرحلة البدء⁵^,⁷^,⁹^,¹⁰^,¹³. أثناء البدء ، يرتبط الوحدة الفرعية الريبوسومية الصغيرة (SSU) ، بمساعدة عوامل البدء eukaryotic (eIFs) ، بالمنطقة غير المترجمة 5 (UTR) من الحمض النووي الريبي (MRNA) حتى يتم التعرف على كودون البداية²^,⁵^,⁶^,⁸^,¹¹^,¹²^,¹³. غالبا ما تستهدف الآليات التنظيمية صناديق الاستثمار الإلكترونية التي تؤثر على المرفقات والمسح الضوئي وبدء التعرف على كودون. على سبيل المثال، عامل البدء eIF2، عامل ترجمة أساسي يساعد في توظيف البادئ Met-tRNA_i^Met إلى SSU، وغالبا ما تستهدف في eukaryotes تحت ظروف الإجهاد⁴^,⁶^,¹¹. في الخميرة ، يمكن أن يسبب الفوسفور من هذا العامل تحت الحرمان من المغذيات والإجهاد التناضحي¹^,⁴^,¹¹^,¹⁴^,¹⁵، وفي خلايا الثدييات، قد تؤدي مجاعة الأحماض الأمينية، والإجهاد الشبكي الإنوبلازمي (ER)، والإجهاد فوق البنفسجي، والعدوى الفيروسية، ومستويات الأكسجين المتغيرة إلى هذه الاستجابة⁸^,⁹^,¹¹. ويتجلى التنظيم السريع لترجمة محددة من الحمض النووي الريبي في استجابة خلايا الثدييات لنقص الأكسيجة، الذي يظهر تثبيطا عالميا للترجمة السريعة وأعلى تنظيما انتقائيا لعوامل نقص الأكxia-inducible (HIFs) التركيب الحيوي. HIFs هي عوامل النسخ ، والتي تثير بعد ذلك إعادة برمجة خلوية على المدى الطويل على مستوى نسخ الحمض النووي⁸^,⁹^,¹⁶. وقد لوحظت استجابات مماثلة في الخميرة تحت الضغط الحراري، مع التعبير السريع عن بروتينات الصدمة الحرارية (HSPs) تليها استجابات متأخرة على مستوى النسخ¹⁷^,¹⁸. بالإضافة إلى الحرمان من المغذيات والصدمة الحرارية، تمت دراسة الاستجابات التحويلية في الخميرة تحت الأكسجين متفاوتة⁸^,¹⁹ملوحة⁵، الفوسفات، الكبريت²⁰^,²¹ والنيتروجين²²^,²³ المستويات. هذا البحث له آثار واسعة النطاق على الاستخدامات الصناعية للخميرة، مثل الخبز والتخمير²⁴^,²⁵. قد تكون الاستجابات الترجمية مفيدة أيضا في تعزيز فهم أمراض مثل الاضطرابات العصبية وأمراض القلب ، والتي تتميز بضغوط داخل الخلايا مثل الإجهاد التأكسدي. وعموما، فإن الاستجابات التحويلية جزء لا يتجزأ من التحكم في التعبير الجيني وتيسر التكيف السريع مع مجموعة واسعة من ظروف الإجهاد في الكائنات الحية النواة.

من أجل دراسة الاستجابات الترجمية، هناك حاجة إلى أساليب توفر لقطات مشوهة الحد الأدنى من المشهد الترجمة. التنميط المتعدد هو نهج كلاسيكي يستخدم في دراسة الترجمة عبر مرنا ، والتي تنطوي على فصل الكسور السومالية البولي (ريبو) من مرنا عن طريق الطرد المركزي الفائق من خلال تدرجات السكروز²⁶^،²⁷. ويمكن استخدام هذا النهج لاستكشاف مستويات الترجمة لmRNAs الفردية (مع أساليب الكشف مثل النسخ العكسي والبوليميراز سلسلة من ردود الفعل، RT-PCR^26)،أو على الصعيد العالمي جنبا إلى جنب مع تقنيات عالية الإنتاجية (microarray أو RNA-seq²⁸^،²⁹). وهناك نهج أكثر تطورا هو التنميط ريبوسوم، التي تسمح لدراسة مواقف ريبوسومات ممدود على طول جزيء مرنا على نطاق الجينوم على نطاق واسع، فضلا عن استنتاج كفاءة الترجمة عبر النسخ واستخدام مواقع البدء الرئيسية والبديلة³⁰^،³¹. التنميط ريبوسوم ينطوي على عزل وتسلسل شظايا مرنا محمية من قبل وجود ريبوسوم عليها. وقد وفرت التنميط ريبوسوم نظرة ثاقبة كبيرة في ديناميات الترجمة عبر عدد من الشروط، بما في ذلك الإجهاد نقص الأكدمة، صدمة الحرارة والإجهاد التأكسدي³¹^،³². وقد تم تكييف هذه التقنية لأنواع المواد مصدر متعددة، بما في ذلك خلايا الخميرة والثدييات.

في حين أن التنميط المتعدد والريبوسوم كان أساسيا في توسيع قدرات البحث في الترجمة ، فإن عملية الترجمة تشمل مختلف الوسائط والمجمعات المترجمة التي يصعب التقاطها بهذه الأساليب¹¹^و¹³. وهناك قيد إضافي ينبع من عدم القدرة على دراسة أنواع الاستجابة السريعة، حيث تستقر المجمعات التحويلية إما في الجسم الحي بإضافة مثبطات ترجمة محددة (المضادات الحيوية)، مما يؤدي إلى بعض القطع الأثرية لتوزيع الريبوسوم، أو الجسم الحي السابق عند تحلل الخلايا على وجه التحديد (المضادات الحيوية) أو بشكل غير محدد (الملح العالي أو أيونات المغنيسيوم)، مما يؤدي إلى حرمان الوسيطات الأقصر عمرا أو الأقل استقرارا³³^، ³⁴^،³⁵.

يستخدم الفورمالديهايد على نطاق واسع للأحماض النووية والبروتينات المتقاطعة، كما هو الحال في دراسات التكفيرية المناعية الكروماتينية (ChIP) والدراسات المناعية المتقاطعة (CLIP). حجمها الصغير و نفاذية الخلية ممتازة تسمح لسرعة في عمل الجسم الحي ³⁶. استنادا إلى الفورمالديهايد السريع الوصلات المتقاطعة، تم تمديد نهج التنميط ريبوسوم مع تسلسل ملف تعريف مجمع الترجمة (TCP-seq)¹⁰^،³⁶^،³⁷^،³⁸^،³⁹^،⁴⁰. TCP-seq، وضعت لأول مرة في الخميرة، ويسمح لالتقاط جميع وسيطة الترجمة، بما في ذلك المسح الضوئي أو بعد إنهاء مجمعات SSU وتكوينات ريبوسومات متعددة^37،^38،^41،⁴². وقد استخدمت هذه الطريقة في العديد من الدراسات¹⁰^،³⁸^،³⁹^،⁴¹^،⁴²، وبعضها يستخدم نهجا الجمع بين كل من مثبطات الترجمة والفورمالديهايد المترابطة لتسهيل القبض على الترجمة. نسخة معدلة أخرى من هذه التقنية ، انتقائية TCP – seq³⁹، وقد استخدمت مؤخرا لتشمل مناعة المجمعات المترابطة ، وتوسيع نطاق التطبيقات TCP – seq. إن الطبيعة السريعة والفعالة والغبيلة للربط بين الفورمالديهايد تجعل هذه النهج مناسبة لدراسة التفاعلات المعقدة العابرة لل ميرنا: الترجمة، لا سيما في سياق مسارات الاستجابة الديناميكية للغاية على مستوى الترجمة.

هنا نحن بالتفصيل عمليات في فيفو الفورمالديهايد الترابط لغرض تحقيق الاستقرار الشامل المعقدة الترجمة والعزلة. نحن نقدم بروتوكولات منفصلة دقيقة للخميرة وخلايا الثدييات (الشكل 1). كما نوضح أمثلة الاستخدام اللاحق للمواد المثبتة عبر الوصلات(الشكل 1)،مثل الكشف عن عوامل البروتين المنقى باستخدام الانتفاخ المناعي (النشاف الغربي)، أو التنقية بمساعدة المناعة (أو “الانتفاخ المناعي”؛ الملكية الفكرية) وإثراء المجمعات الترجمية التي تحتوي على عوامل محددة ذات أهمية، المجهر الإلكتروني وتسلسل الحمض النووي الريبي.

الشكل 1:تخطيطي يصور نظرة عامة على الإعداد التجريبي النموذجي. الخطوات الرئيسية لتثبيت الفورمالديهايد في الجسم الحي للمجمعات الترجمية يتم تصويرها على أنها مخطط انسيابي ، تكملها معلومات حول الصكوك الضرورية الرئيسية. وترد الخطوط العريضة للتطبيقات المحتملة للمواد المترابطة، بما في ذلك الأمثلة التي استخدمت بنجاح ولكن لم يتم تغطيتها مباشرة في هذا البروتوكول، مثل تنقية حبة SPRI من الحمض النووي الريبي، وتسلسل الحمض النووي الريبي، وقياس الطيف الكتلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

1. بروتوكول خلايا الخميرة الخميرة خلية الثقافة والتثبيتملاحظة: يتم تكييف تثبيت الخلية وحصاد من10،38مع التعديلات. إعداد 1 L الخميرة الخلية الثقافة (البرية نوع (WT) BY4741 تعطى كمثال) في شاكر المدارية مع كثافة بصرية تبدأ من لا يزيد عن 0.05 الاتحاد الافريقي في 600 نانومتر (OD600) في وسائل الإعلام المناسبة (1٪ ث / الخامس من استخراج الخميرة, 2٪ ث/5 من البيبتون، 2٪ ث/5 من الدكستروز (الجلوكوز)، 40 ملغم/لتر من كبريتات الأدينين (YPD) المستخدمة كمثال) في ظل الظروف المطلوبة (30 درجة مئوية المستخدمة في هذا التجربة). إعداد جهاز طرد مركزي تحضيري مع الدوار متوافق وزجاجات الطرد المركزي ل بيليه ثقافة التعليق السائل من خلايا الخميرة. لتجارب المجاعة الجلوكوز، بيليه الخلايا مرة واحدة يتم الوصول إلى الكثافة البصرية من 0.6-0.8 الاتحاد الافريقي في 600 نانومتر (OD600)، وذلك باستخدام جهاز طرد مركزي وجيزة في 30 درجة مئوية، 5000 × غرام لمدة 1 دقيقة.ملاحظة: الاحتفاظ بسجل OD من الخلايا المتنامية والسماح للخلايا تنمو حتى OD600 تصل إلى 0.6-0.8 الاتحاد الافريقي، إذا كانت مرحلة النمو الأسي من مصلحة. Resuspend بيليه فورا في الحارة (30 درجة مئوية) وسائل الإعلام YP تحتوي على أي أو منخفضة (0.25٪ ث / الخامس) وأضاف الجلوكوز واحتضان الثقافة لمدة 10 دقيقة أخرى في 30 درجة مئوية في حاضنة شاكر المداري.ملاحظة: قد يؤثر تكوين الوسائط على كفاءة الربط المتداخل اللاحقة. تم اختبار هذا البروتوكول باستخدام YPD فقط. عند إجراء تجارب المجاعة ، فإن الالتزام بالتوقيت وتقليل التأخير بين الإجراءات أمر بالغ الأهمية. بمجرد أن تصبح الخلايا جاهزة، قم بإعداد صندوق ثلج داخل غطاء الدخان مع كوب يحتوي على 250 جراما من جليد الماء المسحوق النظيف. ضمان 25 مل الشريطية والميثانول المشتراة حديثا استقرت 37٪ ث / v حل الفورمالديهايد يمكن الوصول إليها داخل غطاء محرك السيارة. صب الثقافة 1 L في الكأس التي تحتوي على 25٪ ث / الخامس من الجليد المياه المسحوقة.ملاحظة: احتفظ بالخلايا على الجليد طوال جميع العمليات اللاحقة حتى يتم تجميد الخلايا، ما لم يذكر خلاف ذلك. إضافة 75 مل من 37٪ ث / v من محلول الفورمالديهايد إلى تركيز نهائي من 2.2٪ ث / الخامس وتحريك الخليط بشكل مكثف حتى يذوب الجليد. بمجرد ذوبان الجليد، قم بإعداد جهاز توقيت لمدة 10 دقائق.ملاحظة: الالتزام بالتوقيتات الموصى بها ونظام درجة الحرارة لتحقيق نتائج التثبيت القابلة للاستنساخ. بعد احتضان لمدة 10 دقائق، نقل الثقافة إلى زجاجات الطرد المركزي المبردة مسبقا بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 4 درجة مئوية، 5000 × ز لمدة 5 دقائق. في حين أن هذا تدور على, precool أنبوب 50 مل والحفاظ على العازلة الطازجة A (التي تحتوي على الجليسين لتحييد أي الفورمالديهايد المتبقية) على الجليد.ملاحظة: الرجوع إلى الجدول المتوفرة عن تكوينات المخزن المؤقت الدقيق. بعد الطرد المركزي، ضع أنابيب الطرد المركزي على الجليد مع جانب بيليه في اتصال مع الجليد. جلب الأنابيب في غطاء الدخان والتخلص من supernatant في حاوية النفايات الفورمالديهايد. إعادة تشغيل بيليه الخلية من جميع الأنابيب في 20 مل من العازلة A باستخدام شريط 25 مل ونقل إلى أنبوب 50 مل.ملاحظة: هذا الغسل ضروري لتجنب الربط العرضي غير القابل للإلغاء ويجب ألا تتجاوز إضافة العازلة 20 دقيقة من الوقت من حصاد الخلايا. جعل حجم يصل إلى 40 مل مع العازلة A وجمع الخلايا المغسولة عن طريق الطرد المركزي في 4 درجة مئوية، 5000 × ز لمدة 5 دقائق. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 40 مل من العازلة A1، وهو العازلة A لا تحتوي على الجليسين، لإزالة أي تلوث الجليسين. خلايا بيليه مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي في 4 درجة مئوية، 5000 × غرام لمدة 5 دقائق. كرر يغسل مع العازلة A1 مرة أخرى. تجاهل supernatant ووضع بيليه الخلية على الجليد. وزن أنبوب مع بيليه (يجب أن تكون كتلة الخلية الرطب ~ 1 غرام لكل 1 لتر من ثقافة الخلية). خميرة الخلية وخلاية جمع السيتوسول ملء مربع رغوة البوليسترين اصطف مع رقائق الألومنيوم مع النيتروجين السائل إلى عمق حوالي 3 سم. ضع أنبوبا سعة 50 مل منتصبا في الصندوق. Resuspend بيليه (~ 1 غرام كتلة الخلية الرطب) في 550 ميكرولتر من العازلة A2 عن طريق pipetting ودوامة لمدة 10 ثانية. إضافة 10 ميكرولتر من 40 U/ μL من مثبطات RNase ودوامة مرة أخرى لمدة 10 ثانية.تنبيه: ارتداء معدات الحماية المناسبة، مثل القفازات المعزولة حراريا، عند التعامل مع النيتروجين السائل. تأكد من أن أي حاوية تستخدم لعقد النيتروجين السائل لا تسرب، وأن رف أنبوب داخل لن تطفو أو تقع على جانبها. العمل في منطقة جيدة التهوية لتجنب استنفاد الأكسجين. باستخدام ماصة 1 مل، بالتنقيط تعليق الخلية في أنبوب 50 مل التي تحتوي على النيتروجين السائل.ملاحظة: يجب أن يتم التنقيط ببطء وبعناية لتجنب تجميع القطرات. تأكد من تجميد القطرات قبل إدخال قطرات جديدة. نقل أنبوب 50 مل مع قطرات تعليق الخلية المجمدة إلى درجة حرارة الغرفة والانتظار حتى يتبخر النيتروجين السائل تماما. ختم أنبوب مع قبعته وتخزين الكريات الخلية في -80 درجة مئوية أو المضي قدما على الفور.تنبيه: تأكد من أن النيتروجين السائل يتبخر تماما قبل إغلاق الأنبوب. بقايا النيتروجين السائل في أنبوب مختوم يمكن أن يسبب تراكم الضغط الخطرة. للتحضير للخطوة التالية، أنابيب خالية من النيوكلياز 1.5 مل و10 مل من الصلب المقاوم للصدأ طحن الجرار على الجليد الجاف. نقل قطرات تعليق الخلية المجمدة في الجرار باستخدام ملعقة نظيفة ومعقمة.تنبيه: تأكد من أن الجرار طحن مختومة بإحكام. غمر الجرار طحن في النيتروجين السائل لمدة 1 دقيقة ضمان المرحلة السائلة لا تزال تحت تقاطع. إعداد مطحنة خلاط التبريد في 27 هرتز للهياج لمدة 1 دقيقة.ملاحظة: دائما موازنة canister طحن مع آخر واحد من نفس الطراز حتى إذا تطلبت العينة canister واحد فقط للمعالجة. حرض الجرار طحن مختومة في 27 هرتز لمدة 1 دقيقة في مطحنة خلاط. إعادة تبريد الجرار طحن في النيتروجين السائل كما كان من قبل ويهز في 27 هرتز لمدة 1 دقيقة أخرى في مطحنة خلاط. نقل الجرار إلى مربع الجليد التي تحتوي على الجليد الجاف جنبا إلى جنب مع أنابيب خالية من النيوكلياز 1.5 مل. باستخدام ملعقة فولاذية صغيرة ، قم بنقل العينة المسحوقة الناتجة إلى الأنابيب في ~ 100 ملغ aliquots ، وتخزين الأنابيب عند -80 درجة مئوية.ملاحظة: من المستحسن استخدام ~ 600 ملغ من العينة لكل تجربة تشمل تحليل ملف الترسيب المتعدد ، وفصل السيتوسول إلى كسور مترجمة وغير مترجمة ، وفصل إضافي للكسر المترجم إلى SSU ، والريبوسوم ، والكسور الديسوم عند هضم RNase. فصل التعقيدات الثابتة (بولي) ريبوسومات من الكسور غير المترجمة من السيتوسولملاحظة: الإجراء الذي تم إنشاؤه مسبقا10,38ويتبع عموما لإثراء الحمض النووي الريبي المترجمة على أساس الترسيب المشترك مع (بولي) ريبوسومات. يتم إدخال نهج أكثر دقة لفصل الكسور السيتوسول المترجمة وغير المترجمة هنا ، مما يلغي الحاجة إلى التعجيل وإعادة تليين المواد في وقت لاحق.إعداد 2.5 مل خطي 10٪ -20٪ ث/ v تدرجات السكروز مع العازلة B باستخدام طريقة التجميد والذوبان43 في أنابيب الطرد المركزي الجدار رقيقة (5 مل, 13 × 51 مم).ملاحظة: يتم تنفيذ طريقة التجميد والذوبان عن طريق إضافة متتابعة وتجميد طبقات السكروز المخزنة مؤقتا مع تركيزات تنازلية خطيا فوق بعضها البعض. انظر الجدول التكميلي 1 للاطلاع على التفاصيل. لإنشاء وسادة سكروز متقطعة 50٪ ث / v، على التدرجات الخطية ذوبان واستقرار، والاستغناء ببطء 0.5 مل من السكروز 50٪ في العازلة B مباشرة على الجزء السفلي من الأنابيب باستخدام حقنة 1 مل تعلق على 19 G × 1.5 “إبرة أو الشعيرات الدموية الزجاجية ذات أبعاد مماثلة / مناسبة. قبل الاستغناء، بعناية وببطء محرك غيض من الإبرة أو الشعرية من أعلى إلى أسفل من التدرجات السكروز شكلت مسبقا، وتجنب أي اضطراب، حتى تصل إلى أسفل أنبوب.ملاحظة: راجع الجدول التكميلي 1 للحصول على إرشادات حول إعداد المخزن المؤقت B. توازن بعناية التدرجات عن طريق إزالة الأجزاء العلوية أو طبقات أكثر 10 ث / الخامس من السكروز في العازلة B والاحتفاظ بها الجليد الباردة أو في 4 درجة مئوية.ملاحظة: هناك حاجة إلى التدرج المتقطع مع طبقة السكروز 50٪ أسفل لجمع المواد مع ارتفاع معدل الترسيب دون التعجيل به على جدار الأنبوب. ذوبان ~ 100 ملغ من عينة مسحوق الخلية المجمدة في درجة حرارة الغرفة ووضع على الفور على الجليد. مزيج في 150 ميكرولتر من العازلة A2 عن طريق pipetting، إضافة مثبط RNase إلى 1 U/μL ومزيج عن طريق الدوامة (تجنب الرغوة المفرطة والاختلاط مع المرحلة الغازية) لمدة 10 ثانية.ملاحظة: مواصلة جميع العمليات مع الحفاظ على المواد على الجليد، ما لم ينص على خلاف ذلك. بيليه حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي الأنابيب في 4 درجة مئوية، 13،000 × ز لمدة 5 دقائق واستعادة supernatant أوضح (~ 150 ميكرولتر) في أنبوب جديد 1.5 مل منخفضة البروتين ملزمة. قم بتحميل الخليط الموضح الناتج على أنابيب تدرج السكروز المتقطعة من الخطوة 1.3.3 وتوازنها بعناية. طارد فائق الأنابيب في دوار متوسط الحجم دلو سوينغ في 4 درجة مئوية، مع متوسط قوة ز 287980 × ز (ك عامل 49) لمدة 1 ساعة 30 دقيقة.ملاحظة: تم تحسين هذه الشروط مسبقا (باستخدام تحليل تتبع امتصاص الأشعة فوق البنفسجية المتدرجة بعد الطرد الفائق) للاحتفاظ بالجزء الحر (غير (البولي)ريبوسومال) من وحدات SSUs و LSUs (وحدة فرعية ريبوسومية كبيرة) في الجزء العلوي (10٪-20٪ سكروز) من التدرج مع تركيز الكسر (البولي) ريبوسوم في الجزء السفلي (50٪) من وسادة السكروز دون إعادة توجيه المادة. استخدم حقنة معقمة جديدة 1 مل مجهزة بإبرة 19 G x 1.5 ” لجمع كسر السيتوسول المترجم. ضع تدرج 5 مل على رف مستقر لضمان رؤية الجزء السفلي من الأنبوب. من أعلى الأنبوب، عصا الإبرة مباشرة في الجزء السفلي من التدرج (دون ثقب الأنبوب) وبلطف، دون خلق أي فقاعات، رسم بالضبط 0.5 مل من الحل السفلي الذي يحتوي على تجمع الحمض النووي الريبي المترجمة.ملاحظة: تأكد من تنفيذ هذه الخطوة في غرفة باردة ويتم الاحتفاظ الأنبوب بقوة. من المستحسن رسم كامل 0.5 مل في حركة ضربة واحدة لتجنب اضطراب التدرج. تأكيد وجود (بولي) ريبوسومات واستنفاد SSU، LSU وكسور أخف وزنا في الخليط الناتج عن طريق قراءات امتصاص التدرج السكروز على تشغيل الطرد الفائق. ركز تجمع الحمض النووي الريبي المترجم الذي تم جمعه من الخطوة السابقة إلى 100 ميكرولتر باستخدام الترشيح الفائق في جهاز تركيز صغير مع غشاء السليلوز المجدد 10 kDa.ملاحظة: قم بغسل غشاء جهاز التركيز الدقيق مسبقا مع 0.5 مل من العازلة 1 (انظر الشكل 2a)واستخدم ظروف الدوران(g)التي أوصت بها الشركة المصنعة. مزيد من تمييع المواد من الخطوة السابقة خمس مرات (إضافة 400 ميكرولتر) مع العازلة 1 والتركيز مرة أخرى إلى 200 ميكرولتر، للسماح لحجم أصغر، فضلا عن إزالة جزئية من السكروز.ملاحظة: يوصى بتخزين الخلائط الناتجة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر واستخدامها كمادة إدخال لبناء مكتبة RNA-seq RNA المترجمة بالكامل، أو خطوة هضم RNase لبناء مكتبة TCP-seq. يمكن استرداد كسر السيتوسول “غير المترجم” من أعلى التدرج باستخدام إجراء مماثل وتخزينه عند -80 درجة مئوية. RNase هضم الثابتة (بولي) الريبوسومات وفصل المواد المهضومة إلى وحدة فرعية ريبوسومات صغيرة (SSU)، أحادية الريبوسومات (ريبوسومات، RS)، وdribosomal (ديسومات، DS) كسورملاحظة: يتبع الإجراء بشكل عام نهجا تم وصفه سابقا10,38ولكن يتم استخدام نوع التدرج المعدلة، ووقت الفصل، والتسارع وظروف الهضم RNase، لتحقيق أفضل دقة عبر جميع الكسور الثلاثة المعزولة.إعداد متوازن بعناية 12.5 مل خطي 10٪-40٪ ث / الخامس السكروز التدرجات المصنوعة من العازلة 1 في 13 مل رقيقة أنابيب البولي بروبلين الجدار، 14 × 89 ملم، وذلك باستخدام طريقة تجميد ذوبان43 كما هو موضح في الخطوة 1.3.1 ونلاحظ فيه. تذوب في درجة حرارة الغرفة ونقل العينات على الفور على الجليد أو اتخاذ الخلايا المترجمة المركزة والناضب السكروز جزء من الخطوة 1.3.12.ملاحظة: مواصلة كافة الإجراءات على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك. هضم كسر السيتوسول المترجمة عن طريق خلط في 4.5 U من E. coli RNase I لكل 1 OD260 وحدة من الكسر لمدة 30 دقيقة في 23 درجة مئوية. إضافة فورا ومزيج في عن طريق pipetting المانع RNase قادرة على تعطيل RNase I إلى 0.25 U/ μL إلى الخليط، ل inactivate RNase I.ملاحظة: استخدام مثبطات RNase قادرة على تثبيط RNase I. اشتقاق AU260 باستخدام AU260 = (امتصاص في 260 نانومتر موحدة لوحدات الكثافة البصرية ما يعادل 1 سم المسار البصري × حجم الليسات في μL) / 1000. نقل العينات فورا إلى الجليد.تنبيه: من الضروري الالتزام بالشروط الموصى بها للهضم وقياس كمية RNase I المضافة بعناية. تعرف وحدة RNase I المشار إليها هنا بأنها كمية الإنزيم المطلوب لإنتاج 1 ميكروغرام من المواد القابلة للذوبان في الحمض من الحمض النووي الريبي الكبد الماوس في 30 دقيقة في 37 درجة مئوية دفعات RNase I قد يكون لها اختلافات غير موثقة في النشاط وقد تتطلب التجريب لتحقيق ظروف الهضم المثلى. إذا كان مخزون الإنزيم مركزا جدا ، فمن المستحسن تخفيفه بالمخزن المؤقت 1 لتجنب الأنابيب بكميات صغيرة جدا من المحلول. تحميل خليط رد الفعل على 10٪ -40٪ ث / v السكروز التدرجات من الخطوة 1.4.1.ملاحظة: استخدم وحدات التخزين النهائية في نطاق 150-300 ميكرولتر لكل تدرج. يتطلب كل تنقية الحد الأدنى اثنين من التدرجات. استخدام أحجام مدخلات مختلفة من المواد (انخفاض الاتحاد الافريقي260، 10-11 الاتحاد الافريقي260، لDS وأعلى نسبيا الاتحاد الافريقي260، 13-14 الاتحاد الافريقي260، لSSU أو RS) لتحقيق الفصل الأمثل. أجهزة الطرد الفائق الأنابيب في متوسط حجم الأرجوحة دلو الدوار في 4 درجة مئوية مع متوسط ز قوة 178305 × ز (ك عامل 143.9) لمدة 3 ساعة 30 دقيقة.تنبيه: إذا كانت هناك حاجة إلى أنابيب توازن احتياطية، يمكنك موازنة كتلتها وتوزيعها الجماعي مع الأنابيب المحتوية على العينة. استخدام التدرجات السكروز الغيار مضافا مع كمية من العازلة تعادل أن من تراكب العينة وليس أنابيب مع تركيز السكروز موحدة. إعداد جهاز الكسر الانحداري على الأقل 30 دقيقة قبل الانتهاء من دوران الطرد الفائق، بما في ذلك ملء 0.2 ميكرومتر تصفية حل مطاردة الثقيلة (على سبيل المثال، 60٪ السكروز في المياه deionized كما هو مستخدم هنا) في مضخة التشريد.ملاحظة: يوصى بإزالة تلوث خطوط وأنابيب المكسر باستخدام المياه المؤينة ، يليه محلول SDS بنسبة 1٪ -2٪ في الماء المؤين ، والمياه المتأينة ، وأخيرا الإيثانول بنسبة 80٪ في محلول المياه المؤين قبل وبعد الأشواط. ضبط خط الأساس قراءات امتصاص عن طريق ملء النظام أولا مع المياه deionized وصفر البصريات وفقا لتوصيات الشركة المصنعة، ومن ثم تعويض التحول خط الأساس باستخدام الغيار تفريغ 14 × 89 مم السكروز التدرج المحرز مع عازلة مطابقة لأنابيب العينة (على سبيل المثال، العازلة 1).ملاحظة: استخدم نفس سرعة الإزاحة لإجراء التعديلات كما في قراءة العينة، مثل 1.5 مل/دقيقة. قياس حجم التشريد نظام القتلى عن طريق عد الوقت بدقة بين الحل دخول أولا المسار البصري للكشف والظهور لأول مرة في إخراج جامع الكسور.ملاحظة: مع السرعة الموصى بها من 1.5 مل / دقيقة، يمكن إجراء الكسر في درجة حرارة الغرفة. من المستحسن نقل الكسور التي تم جمعها على الجليد على الفور. إجراء الكسر باستخدام قراءات الامتصاص الحية عند سرعة إزاحة 254 نانومتر، وسرعة إزاحة 1.5 مل/دقيقة، والكشف عن الكسور في الخط استنادا إلى موضع الترسيب المتوقع وملف الامتصاص للعينات. استخدام تحويل أنبوب جامع مع تأخير الوقت المقابلة لحجم الميت كما تقاس من قبل. عزل الكسور المقابلة لمواقف وحركة مجمعات SSU و RS و DS وجمعها في أنابيب طرد مركزي صغير جديدة منخفضة البروتين 1.5 مل؛ نقل الكسور المعزولة على الجليد فورا وتجميد إذا لم تتم معالجتها على الفور.ملاحظة: يوصى بتجميد الكسور التي تم جمعها في الثلج الجاف أو النيتروجين السائل فورا وتخزينها عند -80 درجة مئوية أو أقل لمدة تصل إلى 6 أشهر. إزالة الارتباط بين المجمعات الريبوسومية وعزل الجيش الملكي النيبالي لبناء مكتبات RNA-seq لإلغاء كتلة / عكس الوصلات المتقاطعة وعزل الحمض النووي الريبي بعيدا عن البروتينات المرتبطة بها، ونقل ما يقرب من نصف كامل كسور التدرج السكروز في الحمض النووي منخفضة جديدة ملزمة البولي بروبلين خالية من النيوكليز 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيق (350 ميكرولتر لكل أنبوب) مع غطاء السلامة / قفل الأجهزة. تكملة الخلائط مع 40 ميكرولتر من محلول وقف 100٪ (10٪ SDS ث / الخامس و 100 mM EDTA)، 4 ميكرولتر من 1 M تريس-HCl درجة الحموضة 2 في 2 5 درجة مئوية (إلى 10 أمتار)، و1.6 ميكرولتر من 2.5 متر غليسين (إلى 10 أمتار) ومياه خالية من النيوكلياز المؤين للحصول على الحجم النهائي البالغ 400 ميكرولتر. خلط محتويات الأنابيب عن طريق pipetting ونقل الأنابيب في درجة حرارة الغرفة. إضافة حجم متساو من الفينول الحمضية: الكلوروفورم: الكحول isoamyl 125:24:1 (درجة الحموضة 4.0-5.0) خليط إلى كل أنبوب. يهز بقوة الخلائط لمدة 2 دقيقة باستخدام خلاط دوامة تعيين إلى أقصى سرعة.تنبيه: الفينول والكلوروفورم متآكلان وسامان. تجنب ملامسة السوائل بدنيا والعمل في منطقة جيدة التهوية أو تحت غطاء الدخان. استخدم دائما القفازات ومعطف المختبر ونظارات واقية أو درع الوجه عند العمل مع الفينول أو الكلوروفورم. ضع الأنابيب في ثيرموشاكر وهز باستمرار عند 65 درجة مئوية، 1400 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. تسهيل تجميع المرحلة عن طريق الطرد المركزي للخليط عند 12000 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. جمع المراحل المائية العليا ونقلها إلى حمض النوى منخفضة الطازجة ملزمة أنابيب 1.5 مل.ملاحظة: لتجنب التلوث المتبادل، لا تحاول استعادة المراحل المائية تماما. حجم الاسترداد معقولة 300-350 ميكرولتر. تكملة المراحل المائية التي تم جمعها مع 0.1 حجم من خلات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة 5 في 25 درجة مئوية)، 20 ميكروغرام من الجليكوجين (باستخدام 5 ميكروغرام / ميكرولتر المخزون) و 2.5 مجلدات من الإيثانول المطلق. امزج الحلول بعناية عن طريق ربط الأنابيب لمدة دقيقة واحدة. عجل الجيش الملكي النيبالي عن طريق احتضان العينات في -20 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل (موصى به بين عشية وضحاها). تدفئة الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة وتخلط عن طريق الدوامة.ملاحظة: تساعد فترة ما قبل الاحترار للأنابيب والطرد المركزي اللاحق في درجة حرارة الغرفة (دون تقشعر لها الأبدان) على تقليل الملح والفينول المشارك في هطول الأمطار والتفريغ. وينبغي ألا تؤدي هذه الظروف إلى فقدان مادي أو عدم كفاءة جمع الحمض النووي الريبي إذا ما أجريت على النحو الموصوف وباستخدام الإيثانول النقي بما فيه الكفاية. بيليه الجيش الملكي النيبالي يعجل عن طريق الطرد المركزي الأنابيب في 12،000 × ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل supernatant وغسل بيليه مرتين مع 80٪ v/v الإيثانول، وجمعها في كل مرة عن طريق الطرد المركزي في 12،000 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جفف الكريات RNA عن طريق فتح أغطية الأنبوب ووضع الأنابيب المفتوحة في سخان كتلة جافة تعيين إلى 45 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. حل بيليه المجففة الناتجة في 20 ميكرولتر من العازلة HE 1x. تقدير تركيز الحمض النووي الريبي الناتج باستخدام قياس طيف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية.ملاحظة: يمكن تقييم طول جزء الحمض النووي الريبي وإجمالي المبلغ باستخدام إزالة الفلورة الهلامية الكهربائية ، كما هو الحال في جهاز إلكتروفورسيس هلام الشعيرات الدموية الآلي القائم على الفلورسينس. 2- الانتقاء الانتقائي للمناعة المشتركة ل SSUs بواسطة الصناديق الإلكترونية الموسومة وتحليل البقع الغربية لإثراء الوحدة الانتقائيةملاحظة: استخدم ~ 15 AU (260 نانومتر) من كسر SSU المهضوم والمنفصل عن الخطوة 1.4.11 لأداء تنقية التقارب باستخدام حبات IgG المغناطيسية. حفظ ~ 5 ٪ من كسر SSU والتحكم في الإدخال (جزء الإدخال ، وأنا). eIF4A الموسومة (TIF1-TAP; جنبا إلى جنب Affinity الوسم تنقية) تم استخدام سلالة الخميرة مما يجعل من الممكن أيضا للكشف عن eIF4A عن طريق التحقيق ل TAP-العلامة باستخدام الأجسام المضادة للحنفية.نقل 100 ميكرولتر من تعليق حبات IgG المغناطيسي (تم استخدام 1 ملغ من الخرز لكل 15 AU (260 نانومتر) من اللواية أو الكسر) إلى أنبوب جديد منخفض البروتين ملزم 1.5 مل؛ جمع الخرز باستخدام رف المغناطيسي و يستنشق لهم. اغسل الخرز المغناطيسي مرتين مع 1 مل من العازلة 1 باستخدام إعادة الإنفاق التسلسلي عن طريق الأنابيب وجمع باستخدام الحامل المغناطيسي. بعد غسل، وجمع وdecant الخرز، مع الاحتفاظ بها على الرف المغناطيسي. إضافة كسر SSU إلى الخرز غسلها واحتضان الخليط لمدة 4 ساعة مع دوران في 4 درجة مئوية في مجموعة سيكلوميكسر في ~ 20 دورة في الدقيقة. جمع الخرز باستخدام رف المغناطيسي في 4 درجة مئوية وحفظ supernatant (التدفق من خلال كسر، FT). غسل الخرز مرتين في 4 درجة مئوية مع العازلة 1 تكملها مع DTT 4 MM، في كل مرة تدور لمدة 10 دقيقة في سيكلوميكسر وجمع وdecanting الخرز على الرف المغناطيسي. حفظ يغسل (W1 و W2 كسور). لتطبيق تحليلي مثل النشاف الغربي، elute المواد ملزمة تحت إزالة التحلل والحد من الظروف عن طريق إضافة LDS (كبريتات دودسيل الليثيوم) البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (PAGE) عينة العازلة مع pH 8.5 إلى 1x وDTT إلى 2 MM. سخني الخليط عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كتلة حرارية لإنهاء الإلتواء. جمع الخرز باستخدام رف المغناطيسي واستعادة eluate مشوه (E كسر) في بروتين منخفض الطازجة ملزمة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق. استخدم الكسر E من الخطوة السابقة لتشغيل صفحة كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) على الفور، أو تخزين الكسر E عند -20 درجة مئوية.ملاحظة: للحصول على مجموعة تحضيرية من المجمعات الترجمية المخصبة TAP-tag لأي تطبيق لاحق، استخدم نهج elution بديل يستخدم بروتياز فيروس إحفر التبغ (TEV). راجع الجدول التكميلي 1 لمزيد من التفاصيل. لتركيز الكسور المخففة FT و W1 و W2 ، عجل بموادها عن طريق إضافة كميات 3x من الأسيتون البارد الجليدي. احتضان مزيج عينة الأسيتون في -20 درجة مئوية لمدة 3 ساعة. بيليه الراسب عن طريق الطرد المركزي الأنابيب في 13،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant والهواء الجاف بيليه في أنابيب مفتوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. حل بيليه في 7 ميكرولتر من 1x LDS تحميل العازلة تكملها مع DTT 2 mM. سخني العينات في كتلة حرارية تم ضبطها على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحميل كل I، FT، W1، W2، وعينات E على 4٪ -12٪ ث / v من التدرج الأكريلاميد، بيس تريس البولي أكريلاميد هلام الإزالة. تشغيل هلام باستخدام 1x MES SDS (2- [N-موبولينو] حمض الإيثانسولفونيك، كبريتات دودسيل الصوديوم) تشغيل العازلة في 80 V، حتى علامة البروتين (10-250 كدا) يحل بشكل جيد وصبغة الرصاص تصل إلى الجزء السفلي من هلام.ملاحظة: من المستحسن تحميل المخففات التسلسلية ل WCL (lysate الخلية بأكملها) (2-10 ميكروغرام) على الجل كعنصر تحكم. قد يستغرق عدة محاولات لتحقيق تحميل مماثلة من هلام عبر المواد كسر. نقل محتوى البروتين من هلام على غشاء ثنائي فلوريد polyvinylidene (PVDF) عن طريق طريقة نقل الرطب في 100 V لمدة 1 ساعة في غرفة باردة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة للمعدات الغربية النشاف. منع الغشاء باستخدام العازلة حجب المناسبة (الفوسفات العازلة المالحة على أساس) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة تحت اهتزاز مستمر. بعد تعليمات الشركة المصنعة لتخفيف الأجسام المضادة ، تحقق من الغشاء مع الأجسام المضادة ل TAP للكشف عن بروتين eIF4A الموسوم ، أو الأجسام المضادة Pab1p المضادة أو الأجسام المضادة β -actin (أو أي هدف مرغوب فيه آخر) عن طريق حضانة الغشاء بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة المخففة (PBS) المخففة (1:1000 تخفيف) في سيكلوميكسر في غرفة باردة.ملاحظة: تخفيف الأجسام المضادة 1:1,000 نقطة انطلاق جيدة. غسل الغشاء ثلاث مرات مع 1x فوسفات العازلة المالحة، 0.2٪ v/v توين 20 (PBST) لمدة 10 دقيقة لكل منهما. التحقيق في الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية المسمى fluorescently اتباع تعليمات الشركة المصنعة عن طريق احتضان في سيكلوميكسر في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.ملاحظة: 1:20,000 تخفيف الأجسام المضادة نقطة انطلاق جيدة. غسل الغشاء ثلاث مرات مع 1x PBST لمدة 10 دقيقة لكل منهما. شطف لفترة وجيزة الغشاء مع الماء deionized، ومن ثم مع الميثانول المطلق. الجافة وتصور الغشاء في نظام التصوير الفلورسنت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.ملاحظة: يمكن تحقيق تلطيخ للبروتينات الأخرى باستخدام أجسام مضادة ثانوية ذات صبغات مطابقة لقنوات فلورية مختلفة (كما هو الحال في eIF4A-TAP مقابل زوج β-actin المستخدم هنا) ، عن طريق تلطيخ متسلسل أو تجريد وتلطيخ نفس الغشاء أو قطع الغشاء من هلام محمل بنمط متكرر من الكسور والتحقيق بشكل منفصل في كل قطعة مع الأجسام المضادة المعنية (كما هو الحال في مثال Pab1p المستخدم هنا). 2. بروتوكول خلايا الثدييات زراعة الخلايا الثديية والتثبيت في 2 T-175 قوارير، تنمو خلايا HEK293 إلى التقاء 60٪-70٪ في دولبيكو النسر المعدل المتوسط و 10٪ v/v مصل البقر الجنيني في 37 درجة مئوية و 5٪ v/v ثاني أكسيد الكربون.ملاحظة: يتم إجراء الوسائط الكاملة عن طريق إضافة 55 مل من FBS التجارية إلى 500 مل من DMEM المشتراة تجاريا مع ارتفاع الجلوكوز، والتي تحتوي على L-الجلوتامين، الفينول الأحمر وبيكربونات الصوديوم، ولكن لا HEPES أو بيروفاتي الصوديوم. يجب أن يكون عدد الخلايا لكل قارورة T-175 بنسبة التقاء 70٪ في نطاق 1.7-2.0 × 107. على الأقل 3 ساعة قبل وقت التثبيت المطلوب، واستبدال وسائل الإعلام من قوارير T-175 مع 30 مل على وجه التحديد من وسائل الإعلام الكاملة قبل الحارة واستبدال القوارير في حاضنة الخلية.ملاحظة: تأكد من أن يتم pipetted الوسائط الجديدة على الجانب الآخر من القارورة إلى أحادي الخلية لتجنب انفصال الخلية. محاولة إجراء تبادل وسائل الإعلام في أسرع وقت ممكن، وإدخال الحد الأدنى من الغاز واضطراب توازن درجة الحرارة. بمجرد استبدال وسائط الخلية، قم بإعداد المخازن المؤقتة والمواد الكيميائية المطلوبة للتثبيت. إعداد دولبيكو الفوسفات العازلة المالحة (DPBS) مع 50 مل الجليسين بإضافة 10.2 مل من 2.5 M مخزون الجليسين إلى زجاجة 500 مل من DPBS والاختلاط. إعداد زجاجة من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS كما هو الحال في الخطوة 2.1.1 لاستخدامها في ظروف غير معقمة وaliquot 100 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA. مصدر زجاجة إضافية من DPBS التجارية وضعت مسبقا مع كلوريد الكالسيوم (CaCl2)وكلوريد المغنيسيوم (MgCl2).ملاحظة: يمكن تخزين الحلول عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. إعداد مربع الجليد إلى حافة مع الجليد المياه سحقت بحيث قارورة T-175 يمكن أن يصلح بالتساوي على رأس والحفاظ على غطاء محرك السيارة الدخان جنبا إلى جنب مع المخازن المؤقتة المعدة، وأيضا على الجليد.ملاحظة: نظرا للاستجابات السريعة للترجمة إلى أي تغيير بيئي، يجب تقليل جميع الأوقات بين إزالة قوارير الخلية من الحاضنة وإضافة محلول الفورمالديهايد. لالتقاط البرد الخلايا، وإزالة قارورة T-175 من الحاضنة واضغط بقوة ضد الجليد ضمان الاتصال السطحي الأقصى. داخل غطاء الدخان الكيميائي، إمالة القارورة على جانبها بحيث تجمع وسائل الإعلام في الجانب المقابل للخلايا. ماصة 168 ميكرولتر من 37٪ ث / الخامس الفورمالديهايد مباشرة في وسائل الإعلام المجمعة (إلى تركيز النهائي من 0.2٪ ث / v). اخلط القارورة على الفور عن طريق هز القارورة بلطف ذهابا وإيابا، أغلق قارورة الثلج وإعادة وضعها، مما يضمن أنها أفقية وتغطي الخلايا بالتساوي.تنبيه: الفورمالديهايد مادة ضارة مع آثار ضارة محتملة على المدى الطويل وأيضا مهيجة لكل من الجهاز التنفسي والجلد. وينبغي التعامل معها فقط في غطاء الدخان الكيميائي مناسبة. يجب دائما أن تكون مختومة حاويات الفورمالديهايد عندما خارج غطاء الدخان.ملاحظة: تأكد من إضافة الفورمالديهايد مباشرة إلى وسائط الخلية وليس إلى جدار القارورة. الخطوة 2.1.6 يجب أن تأخذ أقل من دقيقة واحدة. احتضان القوارير على الجليد لمدة 10 دقائق أخرى. صب قبالة وسائل الإعلام في حاوية النفايات المناسبة من خلال الجانب قارورة مقابل الخلايا. باستخدام شريطية، ماصة في 30 مل من الفوسفات دولبيكو العازلة المالحة دون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم وبالإضافة إلى ذلك تحتوي على 50 مل الجليسين، بلطف على الجانب المقابل للخلايا. مزيج عن طريق هزاز القارورة. إعادة القارورة إلى الوضع الأفقي واحتضان لمدة 10 دقائق أكثر على الجليد. صب قبالة الحل من خلال الجانب قارورة مقابل الخلايا وإضافة بلطف 7 مل من معيار 0.25٪ ث / v Trypsin-EDTA حل لفصل وإعادة إنفاق الخلايا. احتضان قارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقيقة.ملاحظة: تأكد من أن حل Trypsin-EDTA يغطي جميع الخلايا بالتساوي. استخدام الميل لطيف الدوري والهزاز لتعزيز مفرزة الخلية. نقل قارورة عموديا واستخدام شريط جمع الخلايا المنفصلة عن طريق غسل بلطف أي خلايا المتبقية من جدران القارورة. نقل التعليق إلى أنبوب 50 مل تعيين على الجليد.ملاحظة: يمكن أن تصبح الخلايا الثابتة أكثر هشاشة; لا ماصة بشكل مكثف أو أكثر مما هو مطلوب لفصل الخلايا من جدار القارورة. تكمل فورا تعليق الخلية التي تم جمعها مع 20 مل من وسائل الإعلام كاملة (وسائل الإعلام غير عقيمة الجليد الباردة مع 10٪ FBS) وتخلط عن طريق التقليب بلطف الأنبوب.ملاحظة: تتم إضافة وسائط ثقافة الخلية الكاملة (بما في ذلك 10٪ FBS) لتحييد التريبسين، ومنع المزيد من الضرر لأغشية الخلايا وتفكك الخلايا. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أنبوب 100 × ز لمدة 5 دقائق و 4 درجة مئوية. يجب أن تكون بيليه الخلية واضحة للعيان. صب قبالة وسائل الإعلام وإعادة إنفاق بلطف بيليه الخلية في 10 مل من الجليد الباردة DPBS مع Ca2 +، ملغ2 +، ودون الجليسين. كرر الخطوة 2.1.12. صب قبالة العازلة غسل وإعادة إنفاق بلطف بيليه الخلية في 800 ميكرولتر من الجليد الباردة DPBS مع Ca2 +، ملغ2 +، دون الجليسين ، على الجليد. نقل الخلايا التي أعيد إنفاقها إلى أنبوب جديد منخفض البروتين ملزمة 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق. طرد مركزي الأنبوب في 100 × ز لمدة 3 دقائق و 4 درجة مئوية. تجاهل بعناية supernatant باستخدام ماسورة 1 مل. في هذه المرحلة، يمكن تجميد بيليه الخلية عند -80 درجة مئوية أو المضي قدما إلى خطوة تحلل الخلية.ملاحظة: يمكن تخزين حبيبات الخلايا المجمدة عند -80 درجة مئوية حتى سنة واحدة. وجدنا أن تجميد بيليه الخلية يسهل التحلل اللاحق ونوصي بالتجميد حتى لو لم يتم التخطيط للتخزين على المدى الطويل. اضطراب خلايا الثدييات وجمع السيتوسول في خزانة السلامة الحيوية، أضف 300 ميكرولتر من حاجز التحلل استنادا إلى المنظفات غير الأيونية وغير المدينية و7 ميكرولتر من مثبط U/μL RNase 40. تخلط جيدا عن طريق pipetting باستخدام طرف 1 مل. إرفاق بعناية إبرة 25 G إلى حقنة 1-3 مل وماصة بقوة الخليط، وذلك باستخدام ما لا يقل عن سبعة كمية تصاعدية بطيئة والسكتات الدماغية العادم سريع الهبوط. تجاهل الحقنة والإبرة في سلة حادة وكرر الإجراء باستخدام حقنة 0.3 مل مجهزة بإبرة 31 G. تجاهل الحقنة والإبرة في سلة حادة. طرد الأنابيب في 4 درجة مئوية، 12،000 × ز لمدة 5 دقائق بيليه حطام الخلية. نقل supernatant إلى بروتين منخفض جديد ملزمة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق. تخزين كل من حطام الخلية (لأغراض التحكم) وما نتج عن ذلك توضيح الخلية lysate في -80 درجة مئوية.ملاحظة: تتراوح الكثافة البصرية لليزات بين 25-30 AU260 عند دمج قوارير T-175 واتباع وحدات التخزين الموصى بها. يمكن تخزين الخلايا وبقايا الخلايا عند -80 درجة مئوية حتى سنة واحدة. فصل التعقيدات الثابتة (بولي) ريبوسومات من الكسور غير المترجمة من السيتوسول إعداد خطي 15٪ -45٪ ث / الخامس السكروز التدرجات في 13 مل رقيقة أنابيب البولي بروبلين الجدار، 14 × 89 ملم، وذلك باستخدام طريقة تجميد ذوبان عموما كما هو موضح في الخطوة 1.3.1 من بروتوكول الخميرة، ولكن باستخدام العازلة 2 (الشكل 2a).ملاحظة: إذابة التدرجات بين عشية وضحاها في غرفة باردة في 4 درجة مئوية في الليلة السابقة للكسر. تحميل 150-250 (300) μL من الخلية lysate من الخطوة السابقة 2.2.5 على التدرجات متوازنة. تخزين lysate المتبقية في -80 درجة مئوية واستخدامها لأغراض التحكم.ملاحظة: هنا مثال على الفصل القائم على الترسيب في كسور SSU متعددة الوسوم والريبوسومات و”الحرة”. راجع الجدول التكميلي 1 المقدم للاطلاع على نهج بديل. أجهزة الطرد المركزي الفائق الأنابيب في متوسط حجم الدوار سوينغ دلو في 4 درجة مئوية، متوسط قوة ز 178،305 × ز (ك عامل 143.9) لمدة 1 ساعة 45 دقيقة. 30 دقيقة قبل الانتهاء من الدوران، وإعداد خط الأساس الكسر التدرج، كما هو موضح في الخطوات بروتوكول الخميرة 1.4.7-1.4.9. تجزئة التدرجات عموما كما هو موضح في الخطوات بروتوكول الخميرة 1.4.10-1.4.11.ملاحظة: هذه الخطوة سوف فصل كسور SSU متعددة الأضلاع، ريبوسومال و “الحرة”. يمكن استخدام كسور متعددة الأضلاع في تجارب التنميط المتعدد. نقل الكسور التي تم جمعها على الجليد فورا وإذا لم تتم معالجتها، وتخزينها في -80 درجة مئوية تصل إلى 6 أشهر.ملاحظة: إذا تمت مزامنة تغيير أنبوب جامع الكسور مع تعريف الكسر على الإنترنت والفصل، نوصي باستخدام ما يصل إلى 800 ميكرولتر من الكسور (وقت التجميع 32 ثانية لكل كسر عند 1.5 مل/دقيقة). إذا تم إجراء الكسر دون استخدام قراءات الامتصاص في الخط، فمن المستحسن استخدام كسور 250-500 ميكرولتر (10-20 ثانية لكل كسر عند 1.5 مل/دقيقة). بعد الانفصال ، يمكن استخدام الكسور للتنقية المناعية ، المجهر الإلكتروني ، إزالة النشاف PAGE والنشاف الغربي على الفور ، أو عرضة لعكس الربط المتقاطع لتحليل الحمض النووي الريبي اللاحق و / أو البروتيوميات.

Representative Results

والمجمعات الترجمية حساسة للتكوين الأيوني للمخازن العازلة، وهو أمر مهم بشكل خاص أثناء الطرد المركزي الفائق حيث يتم تقييم خصائص الترسيب. وهكذا اختبرنا العديد من مخازن الترسيب باستخدام الليسات الموضحة المستخرجة من مواد الخميرة الأرضية غير الثابتة ، من أجل تحديد الظروف الأنسب لحل المجمعات التحويلية والوحدات الفرعية الريبوسومية المنفصلة (SSU ، LSU) ، مونوسوم (RS) والبوليسومات عبر التدرج. واستندت جميع المخازن المؤقتة إلى التركيبة الأساسية التي تحتوي على 25 mM HEPES-KOH pH 7.6 و 2 mM DTT. تم تعديل تركيزات KCl و MgCl2و CaCl2و EDTA عبر المخازن المؤقتة(الشكل 2a)، وتم إضافة هذه المكونات إلى الليزيات قبل التحميل المتدرجة وإلى مخازن التدرج السكروز قبل الصب المتدرجة ، وفقا لذلك. في المخازن المؤقتة 1 و 2 تم الحصول على المجمعات الترجمية حلها بشكل جيد. العازلة 1 أدى إلى فصل أفضل إلى حد ما من الوحدات الفرعية الريبوسومية الصغيرة (SSUs) (الشكل 2a). تسبب حذف MgCl2 وإضافة EDTA (المخازن المؤقتة 3،4) في فقدان خصائص الترسيب العالية لمعظم البوليسومات ومن المحتمل أن يكون تفكيكها الجزئي(الشكل 2a). في حين أن إضافة 2.5 mM CaCl2 أدى إلى قمم متعددة السوم أكثر تجانسا إلى حد ما ، كان التحسن هامشيا وانخفض المبلغ الإجمالي للمواد متعددة السوم في هذه الحالة(الشكل 2a)بالمقارنة مع المخازن المؤقتة 1 و 2. وبالتالي اخترنا المخزن المؤقت 1 كعازل العمل المفضل. الشكل 2: الظروف العازلة لاستخراج معقدة الترجمة وتقييم تأثير استقرار التثبيت. تظهر ملامح امتصاص الأشعة فوق البنفسجية التي تم جمعها في 260 نانومتر لإجمالي خلية الخميرة lysate فصل في 10٪ -40٪ ث / v التدرجات السكروز. (أ) آثار الأملاح أحادية و divalent و عزل أيونات المغنيسيوم على ترسيب المواد المستخرجة من خلايا الخميرة غير الثابتة. تمثل الخطوط الحمراء والرمادية نسخة متماثلة نموذجية. (ب, ج) مقارنة بين الليزات المشتقة من غير ثابت (خط رمادي)، 2.2٪ (خط أسود) و 4.4٪ (خط منقط أسود) ث / الخامس من خلايا الخميرة الفورمالديهايد الثابتة. (د)تثبيت البوليسومات بواسطة 0.2٪ w/v المحسن لتثبيت الفورمالديهايد (خط أسود متقطع ومنقط) لخلايا HEK 293T، مقارنة بالمواد من نفس الخلايا غير الثابتة (الخط الرمادي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. نحن فحص المقبل تأثير تثبيت متعدد السوم عن طريق التثبيت مع تركيزات الفورمالديهايد مختلفة. باستخدام المواد الخلية نفسها خلاف ذلك، والمخازن المؤقتة، والتعامل مع الخلايا ونهج التوقيت، قارنا المواد المستخرجة من الخلايا غير الثابتة والخلايا الثابتة مع 2.2٪ و 4٪ ث / الخامس من الفورمالديهايد (الشكل 2b،ج). وجدنا أن 2.2٪ ث /v من الفورمالديهايد كان أكثر ملاءمة للتثبيت كما في حين أنه حافظ بشكل ممتاز على البوليسومات كما يمكن الحكم عليها من خلال نسبة البوليسوم إلى أحادية (الشكل 2ب)، فإنه لم يقلل من العائد الإجمالي للمواد الريبوسومية مقارنة مع 4٪ ث /v من الفورمالديهايد، والتي أظهرت علامات واضحة على الإفراط في التثبيت(الشكل 2ج). بالنسبة للمواد المشتقة من خلايا الثدييات ، نظرا لنسبة حجم التخزين المؤقت للخلية الأكبر التي يتطلبها الاستخراج القائم على المنظفات ، تم استخدام العازلة 2 (الشكل 2a). وقد أدى ذلك إلى مجمعات تحويلية جيدة الحل عند الترسيب في تدرجات السكروز(الشكل 2D). وتجدر الإشارة إلى أنه تم استخدام تركيز أقل بكثير من الفورمالديهايد بنسبة 0.2٪ ث/v، حيث أدت التركيزات الأعلى إلى فقدان مواد كبيرة من البوليسومال والريبوسومات (البيانات غير مبينة). في تشابه مع النتائج التي تم الحصول عليها مع خلايا الخميرة، أظهرت المواد المثبتة عبر الوصلات الحفاظ على أفضل من البوليسومات وارتفاع نسبة تعدد الزوجات إلى أحادية(الشكل 2D). اختبرنا بعد ذلك ما إذا كانت ظروف تثبيت الفورمالديهايد المختارة فعالة بما يكفي لتحقيق الاستقرار في الحمض النووي الريبي المترجم بنشاط داخل الكسور المتعددة الوسوم نتيجة للربط المتبادل ، وتحسين العائد المتعدد السوم ليس مجرد نتيجة لتثبيط وظيفة الإنزيم وتطور استطالة الترجمة. استخدمنا EDTA والملح أحادي التكافؤ العالي (KCl) لزعزعة استقرار البوليسومات والريبوسومات. تمت إضافة هذه الكواشف إلى lysates خلايا الخميرة الموضحة، وشملت في جميع المخازن المؤقتة اللاحقة وتدرجات السكروز على رأس تكوين العازلة 1، على التوالي. في الواقع، أظهرت 15 mM EDTA تأثير زعزعة استقرار أقل على كسور متعددة الخلايا المستمدة من الخلايا الثابتة(الشكل 3a)،مما يؤكد أن المجمعات المترابطة هي أكثر قوة. ويمكن التغلب على الآثار المزعزعة للاستقرار من EDTA إلى حد ما عن طريق زيادة تركيز الفورمالديهايد، كما قاومت المواد من 4٪ ث / الخامس من الخلايا الثابتة الفورمالديهايد تتكشف بشكل أفضل(الشكل 3a). ومع ذلك، أدى زيادة تركيز EDTA إلى 50 mM إلى زعزعة استقرار معظم المجمعات الانتقالية في ظل ظروف ثابتة وغير ثابتة على حد سواء، كما يمكن استنتاجه من تباطؤ ترسيب المواد وعدم وجود قمم جيدة الشكل(الشكل 3ب). ويمكن تفسير ذلك من خلال التكشف الجزئي للهياكل والخسارة الإجمالية للانضاك، وليس بالانفصاء الكامل للمكونات المتعددة الوسوم عن الحمض النووي الريبي. وحتى في هذه الحالة، أظهرت المواد المترابطة ترسبا أسرع(الشكل 3ب). الشكل 3: آثار في تثبيت الفورمالديهايد الخميرة في الجسم الحي على استقرار البوليسومات. تم استخدام المخزن المؤقت 1 (انظر النص والشكل 2a)في جميع التجارب. نوع البيانات ورسم كما هو موضح في وسيلة إيضاح الشكل 2. (أ)مقارنة بين إضافة EDTA 15 mM إلى lysates الخلية والمخازن المؤقتة اللاحقة على استقرار البوليسومات المستمدة من غير ثابتة (خط رمادي)، 2.2٪ (خط أسود) و 4٪ (خط منقط أسود) ث / الخامس من الخلايا الثابتة الفورمالديهايد. (ب) نفس (أ)، ولكن لإضافة 50 mM EDTA واستبعاد 4٪ ث / الخامس من الخلايا الثابتة الفورمالديهايد. (ج) نفس (أ) ، ولكن لإضافة 500 MM KCl وباستثناء 2.2 ٪ ث / الخامس من الخلايا الثابتة الفورمالديهايد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. على غرار آثار EDTA، في 500 MM KCl، وجدنا تحسنا كبيرا في الاستقرار مع 4٪ ث / الخامس من تثبيت الفورمالديهايد(الشكل 3c). ويمكن أيضا تفسير فقدان واضح من الاتفاق في هذه الحالة عن طريق انفصال جزئي من مكونات المجمعات الريبوسومية، بدلا من الفصام الكامل من الجيش الملكي النيبالي. وبشكل عام، أظهرت البوليسومات المشتقة من الخلايا الثابتة بالفورمالديهايد مقاومة أعلى للاستقرار الهيكلي الذي يتكشف، بما يتفق مع تشكيل روابط إضافية مشتركة داخل هذه المجمعات. خلال ظروف النمو المحفزة، يمكن البدء في الرناس بسرعة مما يؤدي إلى تراكم الريبوسومات المتعددة على جزيئات الحمض النووي الريبي نفسه، والتي تشكل هياكل تعرف باسم البولي ريبوسومات، أو البوليسومات. يمكن فصل البوليسومات عن طريق الطرد المركزي الفائق في تدرجات السكروز ، حيث ترسيبات بناء على ترتيبها (عدد الريبوسومات المرفقة في وقت واحد على الحمض النووي الريبي). عندما يتم قمع الترجمة، تفشل الريبوسومات في المشاركة في جولة أخرى من الترجمة في وقت قريب بما فيه الكفاية، مما يؤدي إلى (جزئي) “تفكيك” من البوليسومات، والذي يظهر كتحول مشروط نحو البوليسومات من ترتيب أقل وتراكم أحادية4،26. ويمكن توفير نموذج للاستجابة الترجمية التي يمكن تصورها على مستوى توزيع النظام متعددة الأضلاع عن طريق المجاعة الجلوكوز. استنفاد الجلوكوز يثير واحدة من الآثار المثبطة الأكثر دراماتيكية وسريعة على الخميرة1،3،40. أظهرت الدراسات السابقة أنه في غضون دقيقة واحدة من استنفاد الجلوكوز ، يمكن أن يحدث فقدان البوليسومات ، وتراكم أحاديات وتثبيط بدء الترجمة4. في غضون 5 دقائق من إعادة تكملة الجلوكوز، يتم استعادة الترجمة بسرعة مع زيادة واضحة في البوليسومات3،4. ولوحظ أيضا أن الترجمة كانت مثبطة عندما تعرضت الخلايا لوسائط تحتوي على جلوكوز بنسبة 0.5 في المائة (ث/5) أو أقل ولم يكن هناك أي تأثير شوهد في مستويات الجلوكوز بنسبة 0.6 في المائة (ث/5) أو أعلى. وبالتالي، فقد أردنا تحديد ما إذا كانت شروط التثبيت لدينا مناسبة للحفاظ على الاختلافات التحويلية ضمن ديناميكيات الاستجابة لإجهاد الجلوكوز، كما يمكن تقييمها من خلال نسبة تعدد الدم إلى أحادية. قارنا المواد من الخلايا التي تزرع في مرحلة منتصف الأسي على ارتفاع الجلوكوز (2.00٪ ث / v المضافة) مع تلك التي تم نقلها لمدة 10 دقيقة في وسائل الإعلام مع عدم أو انخفاض المضافة (0.00٪ أو 0.25٪ ث / الخامس، على التوالي) الجلوكوز. وقد تم تنفيذ التثبيت باستخدام 2.2٪ ث / الخامس من الفورمالديهايد بالتوازي في السيطرة (غير جائع؛ استبدال وسائل الإعلام السريع مع نفس وسائل الإعلام القياسية التي تحتوي على 2٪ ث / الخامس المضافة الجلوكوز، تليها حضانة لمدة 10 دقيقة والتثبيت) و 10 دقيقة يتضورون جوعا (استبدال وسائل الإعلام السريع مع نفس وسائل الإعلام ولكن منخفضة 0.25 ث / الخامس أو لا الجلوكوز المضافة، تليها حضانة لمدة 10 دقيقة والتثبيت) الخلايا. بما يتفق مع النتائج السابقة، لاحظنا أن خلايا الخميرة قمع بشدة الترجمة على الإجهاد المجاعة الجلوكوز(الشكل 4a). على حد سواء، لا ظروف الجلوكوز المضافة والمنخفضة تسبب تفكيك متعدد الأضلاع، مع القليل ولكن من الواضح أكثر البوليسومات الاحتفاظ بها في حالة انخفاض الجلوكوز المضافة. وبالتالي، قد لا تكون استجابة إزالة الجلوكوز الخميرة من نوع شامل أو شامل ويتم ضبطها تدريجيا. تأكيد التوقعات للعمل استقرار الفورمالديهايد الوصلات المتقاطعة، أظهرت المواد متعددة الخلايا من الخلايا الثابتة تمييز أعلى بين الخلايا الجائعة وغير المتعطشة، يمكن القول الحفاظ على نطاق ديناميكي أعلى من الاستجابة(الشكل 4ب). ومن المثير للاهتمام، في حالة المواد من الخلايا الثابتة، وانخفاض تركيز الجلوكوز المضافة أدى إلى وفرة متعددة الوسوم محددة التي هي أفضل بكثير تختلف عن حالة الجلوكوز لا المضافة، مقارنة مع الخلايا غير ثابتة(الشكل 4a). وهذا مؤشر قوي على مدى ملاءمة نهج تثبيت الفورمالديهايد في الحفاظ على الاختلافات الدقيقة والعابرة نسبيا والتقاطها في توازن العمليات الدينامية للغاية، كما هو الحال أثناء الاستجابات التحويلية. الشكل 4: التقاط التغيرات السريعة في ترجمة الخميرة على تجويع الجلوكوز. تم استخدام المخزن المؤقت 1 (انظر النص والشكل 2a)في جميع التجارب. نوع البيانات ورسم كما هو موضح في وسيلة إيضاح الشكل 2. (أ)lysates الخلية التي تم الحصول عليها من غير المتعطشة (خط رمادي)، مقيد الجلوكوز المتعطشة (0.25٪ ث / الخامس وأضاف الجلوكوز لمدة 10 دقيقة؛ الخط البني) والجلوكوز المستنفدة (لا الجلوكوز المضافة لمدة 10 دقيقة؛ الخط الأحمر) خلايا الخميرة غير ثابتة. (ب) نفس (أ)، ولكن ل2.2٪ ث / الخامس الخلايا الفورمالديهايد الثابتة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. رصد الحالة الترجمية من قبل ريبوسومات المرتبطة بنشاط ترجمة مرنا باستخدام السكروز الترسيب التدرج (‘التنميط متعدد الأضلاع’) هو تقنية تطبيقها على نطاق واسع26,27,28. في تركيبة مع التحليل الميكروي الكمي ومؤخرا مع تسلسل الإنتاجية العالية28،44، يوفر التنميط المتعدد المعلومات حول الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم على نطاق واسع. مع العديد من الافتراضات، كان يجادل تقليديا في مجال البحوث التمثيل الحيوي البروتين أن وجود متعدد الوسوم هو مؤشر على المشاركة النشطة في ترجمة mRNAs المعنية. استنتاج آخر هو في كثير من الأحيان (ولكن ليس دائما) مبررة، أن أكثر ريبوسومات موجودة على مرنا من طول معين (كلما ارتفع ترتيب البوليسومات)، وأكثر نشاطا أن تشارك ميرنا في الترجمة. وبالتالي ، يمكن فصل كسر متعدد السوم من بقية المواد تكون مفيدة من وجهة نظر عزل الجيش الملكي النيبالي المترجمة بنشاط. ضمن نهج التنميط البصمة، وخاصة TCP-seq10،38،39 الذي يولد مجموعة منفصلة من وحدات SSUs المحررة المستمدة من مجمعات المسح الضوئي والبدء والتوقف عن كودون ، قد يكون بالإضافة إلى ذلك الثاقبة لإزالة الوحدات الفرعية الريبوسومية التي لا تشارك في الرواسب مع أحادية كاملة أو البوليسومات. وهكذا قمنا بتوظيف فصل mRNPs “غير المترجمة” مثل وحدات SSUs المجانية (mRNA ملزمة ب SSU أو SSUs واحدة دون mRNA مرفق) بعيدا عن مجموعة “الترجمة النشطة” من الحمض النووي الريبي. ولتحقيق ذلك، افترضنا أن الرناس المشارك في التفاعلات مع أي من الريبوسومات (أحادية) أو عدة ريبوسومات (بوليسومات) يمكن ترجمتها بنشاط. ويمكن فصل هذه المجمعات عن غيرها بمعامل الترسيب الأعلى. واقترحنا أيضا فصل بركة “مترجمة بنشاط” من mRNAs إلى وسادة السكروز (50٪ ث / الخامس من السكروز) بدلا من الكريات مباشرة المواد على جدار أنبوب. الطرد المركزي للمجمعات الترسيب السريع في وسادة سمح لنا لرصد فصل باستخدام قراءات ملف امتصاص وتحقيق إنتاج أعلى من المواد solubilized، غير مجمعة وغير مشوهة، مقارنة بيليه وإعادة التشحيم10،38. عموما، لتنقية وحدات SSUs الفردية، الريبوسومات، الديسومات، والبوليسومات معبأة بشكل مضغوط يحتمل أن تكون ذات ترتيب أعلى، تعرضت الليسات أوضح ثابتة لعملية الطرد المركزي الفائق على مرحلتين(الشكل 5). في أول تدرج السكروز، أدى الطرد الفائق إلى فصل وحدات SSUs و LSUs المجانية في الجزء العلوي (10٪-20٪ ث/v من السكروز) جزء من التدرج، في حين أن التجمع المترجم المترابط بما في ذلك البوليسومات و mRNAs المرتبطة بريبوسوم كامل واحد تركز في الجزء السفلي (50٪ w/v من السكروز) من التدرج (الشكل 5a ). أسفل 50٪ ث / الخامس من طبقة السكروز التي تحتوي على تجمع مرنا المترجمة ثم تركزت وهضم الحمض النووي الريبي لها مع RNase I، تليها ثانية السكروز الانحدار الطرد الفائق للحصول على منفصلة SSU، LSU، RS، RNase مقاومة ثنائيات (DS) وجزء صغير من البوليسومات المقاومة للنيوكلياز أعلى ترتيب(الشكل 5ب). وأكد تلطيخ السلبية مع خلات أورانيل والتصوير مع المجهر الإلكتروني انتقال هوية المجمعات معزولة في كل مرحلة الترسيب (الشكل 5). الشكل 5:عزل مجموع الكسور RNA المترجمة بعيدا عن الجيش الملكي النيبالي غير المترجمة. (أ،ج)التخطيطي (يسار) والنتائج التمثيلية المعنية (يمين؛ نوع البيانات والتآمر كما هو موضح في الرسم البياني 2 أسطورة) من (أ) الفصل الأول التدرج السكروز متقطعة من كسور السيتوسول غير المترجمة بما في ذلك وحدات دعم أمن الخلايا الحرة وتجمع مرنا المترجمة التي تم تحديدها عن طريق الترسيب المشترك مع الريبوسومات والبوليسومات، و (ج) فصل المجمعات الريبوسومية الفردية المحررة من تجمع مرنا المترجمة من قبل RNase I التي تسيطر عليها الهضم والطرد الفائق من خلال الانحدار السكروز الخطي الثاني في SSU، LSU، ريبوسومال (RS)، وكسور ديسوماليس مقاومة للنيوكليز (DS). تم تضمين كميات عالية (15 الاتحاد الافريقي260)ومنخفضة (8 الاتحاد الافريقي260)من المواد المهضومة غير المتعطشة لإثبات إمكانية زيادة الأحمال الطرد الفائق عندما تكون كسور طفيفة من مصلحة. ويمكن أيضا تحديد البوليسومات المقاومة للنيوكلياز الأعلى ترتيبا (مثل الثلاثيات في الأمثلة المقدمة). (ب, د) صور TEM التمثيلية لكسور خلات أورانيل المتناقضة من (a, c), على التوالي كما وصفت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. من أجل التحقق من ملاءمة نظام التثبيت للاحتفاظ بالبروتينات العابرة المرتبطة بالريبوسوم (خاصة ، eIFs) ، اختبرنا للترسيب المشترك ل eIF4A ، وهو 2000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 استفدنا من eIF4A Tandem Affinity Purification (TAP) سلالة الخميرة الموسومة (TIF1-TAP) وحققنا في وجود eIF4A في المواد المشتقة من الخلايا الثابتة مقابل غير الثابتة باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة TAP ، مقارنة بوفرة Pab1p كتحكم إضافي ملزم للجيش الملكي النيبالي ، باستخدام SDS-PAGE يليه النشاف الغربي(الشكل 6). الشكل 6: استقرار البروتينات العابرة في المجمعات الترجمية على تثبيت في فيفو الفورمالديهايد. (أ، ب) ( أعلىالمؤامرات) lysate الخلية الكاملة (WCL) من (أ) غير ثابتة و (ب) 2.2 ٪ الفورمالديهايد الثابتة eIF4A-TAP خلايا الخميرة مفصولة بالطرد الفائق وتصور كما هو موضح في أسطورة الشكل 2. (المؤامرات السفلية) التصوير الغربي لطخة من الكسور التدرج السكروز المعنية عند فصل المواد التي تم تحليلها في التدرجات المقابلة (أعلى المؤامرات)، وWCL كعنصر تحكم. (ج) متوسط النسبة بين وفرة eIF4A أو Pab1p في كسور المواد الثابتة وغير الثابتة. تم حساب النسب النسبية (تطبيعها إلى إشارة جميع الكسور 2-7) من eIF4A (القضبان السوداء) وPab1p (القضبان الرمادية) عبر 2،3 (SSU ، LSU) ، 4،5 (RS ، البوليسومات الخفيفة) ، و 6،7 (البوليسومات الثقيلة) من بيانات (a،b) (قطع الأرض السفلية) ، ونسبتها الثابتة إلى غير الثابتة المأخوذة. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري للنسبة من الوسط مع الكسور المجمعة (المربعات المنقطة) التي يتم التعامل معها على أنها نسخ متماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. بما يتفق مع وفرة عالية في الخلايا، لاحظنا كثافة عالية للإشارة من كل من البروتينات في lysate الخلية بأكملها (WCL) وكسور أبطأ الترسيب المستمدة من الخلايا غير الثابتة(الشكل 6a،لوحة أسفل). كما اكتشفنا كميات كبيرة من هذه البروتينات في WCL المستمدة من الخلايا الثابتة ومطمئنة كفاءة استخراج المواد المترابطة وعدم وجود خسائر غير متوقعة(الشكل 6ب، لوحة القاع). ومع ذلك ، على النقيض من الخلايا غير الثابتة ، أظهرت المواد من الخلايا الثابتة وجودا نسبيا مرتفعا ل eIF4A في الكسور الريبوسومية الأسرع ترسبا ، مقارنة ب Pab1p(الشكل 6c). وتشير هذه النتيجة إلى أن eIF4A لا يزال أكثر ارتباطا مع البوليسومات في المواد الفورمالديهايد المترابطة. بعد التأكد من التأثير الإيجابي والمحدد لتثبيت الربط المتبادل على وجود eIF4A في الكسور الريبوسومية ، استخدمنا المواد الثابتة من سلالة الخميرة الموسومة ب eIF4A (TIF1-TAP) لالتقاط وإثراء المجمعات المحتوية على eIF4A عن طريق تنقية تقارب مع حبات IgG المغناطيسية. لدينا WCL إثراء تقارب، كسور SSU و polysomal (تجمع مرنا مترجم) بعد الترسيب الأول من خلال تدرج السكروز (على سبيل المثال، القسم 1.3 من بروتوكول الخميرة)، وكذلك كسور SSU و LSU و RS من الترسيب الثاني عند تفكيك المجمع المترجم إلى مجمعات فردية مع RNase I (على سبيل المثال، القسم 1.4 من بروتوكول الخميرة) (الشكل 7 ). في جميع الحالات، باستثناء كسر LSU، تمكنا من مراقبة الإثراء الانتقائي للeIF4A في الكسور المنقى (eluate، E)، بالمقارنة مع وجود β-actin في المواد المصدر (الإدخال، I)(الشكل 7). الشكل 7:تنقية مناعية انتقائية في المجمعات الترجمية المستقرة في الجسم الحي من خلال eIF4A المرتبطة عابرا. يوضح التخطيطي مصدر المجمعات المختلفة والخلاصة eIF4A ، بما في ذلك WCL الموضح غير مجزأ لخلايا الخميرة eIF4A-TAP ؛ وحدات SSUs المجانية ومسبح الحمض النووي الريبي المترجم (البوليسومات) المنفصل في الطرد المركزي الفائق الأول؛ SSU، LSU و RS الكسور المحررة من الجيش الملكي النيبالي المترجمة من قبل RNase I الهضم وفصلها باستخدام الطرد المركزي الفائق الثاني (انظر النص). صورة لطخة الغربية يوفر تصورا لوفرة eIF4A في الكسور مقارنة مع وفرة من السيطرة β-actin ملطخة في وقت واحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الجدول التكميلي 1 – الجداول التكميلية 1- الجداول التكميلية الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

تثبيت الفورمالديهايد هو وسيلة مريحة وشعبية لتحقيق السريع في التشابك في الجسم الحي من الجزيئات الحيوية¹⁰^،³⁶^،⁴⁵^،⁴⁶^،⁴⁷^،⁴⁸. بالمقارنة مع أهداف الجزيئات الحيوية المحتملة الأخرى ، يتطلب الالتقاط الناجح للمجمعات التحويلية تثبيتا فوريا أثناء تقشعر لها الأبدان للخلايا أو غيرها من المواد. وبدون الاستقرار غير المحدد، هناك إمكانية لاستمرار العمليات المختلفة المتعلقة بالترجمة، وتحويل التوزيع المعقد بعيدا عن حالة الجسم الحي ⁴⁹غير المضطربة. بالمقارنة مع الطرق الأخرى للاعتقال الترجمي والاستقرار المعقد الريبوسومي ، فإن سرعة عمل الفورمالديهايد عبر أغشية الخلايا والطبيعة العشوائية للروابط المتقاطعة تعد بالحفاظ على التنوع الأقصى للوسطاء مجمع الترجمة أقرب إلى دولهم الموزعة أصلا^50.

وقد تم إنشاء النهج المعروض هنا وتحسينه في كل من خلايا الخميرة والثدييات ، وقد تم الآن اشتقاق الأساليب من قبل مجموعات أخرى لاستخدامها عبر مواد بيولوجية أكثر تنوعا ، كما هو الحال في الفقاريات الكاملة (على سبيل المثال ، أجنة حمار وحشي)¹⁰^،³⁸^،³⁹^،⁴⁹^،⁵¹^،⁵² . وعلى الرغم من أن هذه الأعمال تطمئن مجتمعة إلى تعدد استخدام النهج وقابليته للتطبيق على نطاق واسع، فإن الربط المتبادل السريع بين الفورمالديهايد للمجمعات التحويلية يمكن اعتباره صعبا إلى حد ما في نقلها إلى أنواع جديدة من المواد البيولوجية بسبب الحاجة إلى التحسين والتعديلات.

شرط قبل كل شيء لنجاح هذه الطريقة هو إعادة الأمثل لتركيز الفورمالديهايد وجمع الخلية وتقنية تعطيل. أقل نفاذية، خلايا الخميرة الصغيرة والجولة تتطلب أعلى من ذلك بكثير (على الأقل، 10 أضعاف) تركيز الفورمالديهايد والاضطراب البدني للخلايا الثابتة. وعلى النقيض من ذلك، يمكن بسهولة الإفراط في إصلاح خلايا الثدييات الكبيرة والمسطحة في الثقافة وتتطلب التعامل اللطيف عند التثبيت، في حين يمكن إجراء استخراج المجمعات الثابتة كيميائيا مع تعطيل الأغشية باستخدام المنظفات. قد يسمح الارتباط الناقص للوسطاء الأقل استقرارا أو الأكثر قصرا بالانفصاع أو التسرب إلى حالة لاحقة. قد يؤثر الإفراط في الربط المتبادل سلبا على القدرة على عزل ودراسة الكسور الريبوسومية ويمكن أن يخلق تحيزات انتقائية مثل استنفاد أعمق للمجمعات الثقيلة. في ملاحظتنا، حتى التعديلات الطفيفة، مثل نوع الخلايا البشرية الملتصقة المستخدمة، يمكن أن تؤثر على غلة المجمعات المترابطة المستردة وقد تتطلب إعادة تحسين نظام الربط المتبادل. يمكننا أيضا أن نتوقع أن الخلايا ذات خصائص نفاذية مختلفة إلى حد كبير ، مثل الخلايا النباتية ، سوف تتطلب تحسينا إضافيا واسع النطاق لظروف التثبيت⁵². ومع ذلك، من الصعب تصور نوع من المواد البيولوجية التي من شأنها أن تتعارض تماما مع النهج.

أحد الاعتبارات ذات الصلة ببروتوكول تثبيت الثدييات هو كثافة وكمية مواد الخلية المستخدمة كمدخلات. من المستحسن أن يكون الخلايا تنمو باستمرار دون إعادة البذر أو غيرها من الاضطرابات لمدة يومين على الأقل لتجنب التأثيرات الخارجية على ديناميات الترجمة الخلوية. ينطبق على معظم أنواع الخلايا، ولكن بالنسبة لغالبية الخلايا الملتصقة حققت باستمرار مستويات التقاء لا تزيد عن 70٪ سيضمن عدم وجود آثار تثبيط الاتصال الرئيسية التي يمكن أن تؤثر سلبا ولا يمكن التنبؤ بها معدلات الترجمة.

وثمة سمة أخرى مثيرة للاهتمام، وربما مريحة بشكل فريد، من تثبيت الفورمالديهايد الناجمة عن التفاعل العشوائي هو تأثير الاستقرار على المجمعات التحويلية في أنظمة التصنيف المختلط. البكتيرية ، وحتى أكثر من ذلك المجمعات المترجمة من الميتوكوندريا ، الكلوروبلاستات والطفيليات داخل الخلايا المختلفة ، كان من الصعب استهدافها بمثبطات ترجمة محددة. في المقابل ، في بيانات TCP-seq ، يمكن ملاحظة رسم خرائط آثار الأقدام إلى mitotranscriptome بسهولة في البيانات³⁸^و³⁹^و⁵⁰. ومن التطورات اللاحقة المثيرة للاهتمام استخدام النهج للتحقيق في الترجمة في اتصالات دقيقة كاملة، كما هو الحال في عينات التربة أو المياه أو الأمعاء، حيث يكون الاعتقال السريع الموثوق به وتثبيت الاستقرار المعقد بأي وسيلة أخرى أمرا إشكاليا.

وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه بالنسبة للمواد الأكثر تعقيدا (مثل الأنسجة الصلبة و / أو الضخمة) ، لا شيء يمنع استخدام تثبيت الفورمالديهايد فور انقطاع الخلية وتجانس المواد. هذا النهج يستخدم بالفعل في كثير من الأحيان لإزالة تأخير دخول الخلية عند استقرار المجمعات الترجمية مع مثبطات جزيء صغير محدد³³^،⁵³^،⁵⁴^،⁵⁵. وبالنظر إلى أن تثبيت الفورمالديهايد قد استخدمت تقليديا مع نتائج ممتازة لتثبيت العينة في الجسم الحي / في المختبر السابق في تطبيقات مثل المجهر الإلكتروني⁴⁵^،⁵⁶^،⁵⁷^،⁵⁸، يمكننا أن نتوقع تأثيرات سلبية أقل في هذه الحالة ، لا سيما تلك المرتبطة باستخراج الفقراء من المجمعات التحويلية من الخلايا الثابتة تماما.

تؤكد النتائج التي توصلنا إليها قابلية تثبيت الفورمالديهايد السريع لتحقيق الاستقرار في المجمعات العابرة للغاية ، مثل تلك التي تشمل eIF4A. ومن الجدير بالذكر أنه على النقيض من الثدييات، ترتبط الخميرة eIF4A بشكل أضعف بكثير مع eIF4F المعقد الملزم للغطاء، ونتيجة لذلك، المجمعات التحويلية بشكل عام. عادة ما يتم فقدان eIF4A خلال أي تنقية واسعة النطاق للمادة ريبوسومات في الخميرة²⁹^،⁵⁹^،⁶⁰^،⁶¹^،⁶²^،⁶³. ومع ذلك ، في المواد الخميرة في الجسم الحيالثابت ، فمن الممكن تحقيق إثراء موثوق بها من eIF4A في جميع أجزاء المجمعات التحويلية حيث سيكون من المتوقع وجودها. وقد أظهرت البيانات المنشورة سابقا Sel-TCP-seq إثراء eIF2 و eIF3 التي ترتبط بقوة أكبر مع الريبوسومات (ولكن كشفت أيضا عن حدوث عابر مجمع البروتين المشترك الترجمي التجميع)³⁹. وهكذا، فإن الطريقة مناسبة للكشف عن كل من المكونات المرفقة أقوى وأضعف من المجمعات الترجمية.

باختصار، قدمنا نهجا مفيدا للحصول على رؤى في المقام الأول حول التغيرات التي تحدث في مرحلة بدء الترجمة وعندما يكون التوزيع الريبوسومي المضطرب على الحمض النووي الريبي مطلوبا. والأهم من ذلك، أن هذا النهج مناسب لتثبيت المكونات الشفهية والدينامية نسبيا للمجمعات التحويلية، مثل eIF4A، ويمكن استخدامه على نطاق واسع رهنا بالتحسينات اللازمة. كما قدمنا أدلة على فائدة تثبيت الفورمالديهايد في سيناريوهات التغير الديناميكي السريع للترجمة، وفتح مجالات التحقيق مثل الاستجابات الخلوية سريعة الخطى للتغيرات البيئية أو ظروف الإجهاد.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منحة مشروع اكتشاف مجلس البحوث الأسترالي (DP180100111 إلى T.P. و N.E.S) ، ومنحة محقق مجلس الصحة والبحوث الطبية الوطني (GNT1175388 إلى N.E.S. ) وزمالة الأبحاث (APP1135928 إلى T.P.). ويعترف المؤلفان بمرافق المجهر الأسترالي في مركز المجهر المتقدم، الجامعة الوطنية الأسترالية، وهو مرفق تموله الجامعة والحكومة الاتحادية.

Materials

Yeast extract	Merck, Sigma-Aldrich	70161
Peptone	Merck, Sigma-Aldrich	70178
D-Glucose (Dextrose)	Merck, Sigma-Aldrich	49139
Adenine sulphate	Amresco	0607-50G
Formaldehyde solution	Merck Sigma-Aldrich	F11635-500ML	ACS reagent, 37 wt. % in H₂O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Invitrogen™ byThermo Fischer Scientific	10777019
cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	COEDTAF-RO Roche by Merck	11873580001
Magnesium chloride solution	(Merck/Sigma-Aldrich)	M1028
Ethylenediaminetetraacetic acid solution	(Merck/Sigma-Aldrich)	E7889
Ambion™ RNase I, cloned, 100 U/µL	Ambion	AM2294
SUPERase•In™ RNase Inhibitor (20 U/μL)	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific	AM2694
Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)	(Merck/Sigma-Aldrich)	P1944-100ML
Dynabeads™ Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific)	11033
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific)	AM9740
Glycogen (5 mg/ml)	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific)	AM9510
Ethyl alcohol, Pure	Merck; Sigma Aldrich	E7023
Amersham^™ Hybond^® P Western blotting membranes, PVDF	Merck	GE10600023	PVDF membrane for western blotting
Bolt™ 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel	Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific	NW04120BOX	Protein gel
4X Bolt™ LDS Sample Buffer	Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific	B0007	LDS sample loading buffer
Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Prestained Protein Standards	BioRad	1610375	Protein ladder
20X Bolt™ MES SDS Running Buffer	ThermoFischer Scientific	B0002	PAGE runninjg buffer
Intercept® (PBS) Blocking Buffer	LI-COR	927-70001	Odyssey Blcoking buffer (PBS)
IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	92632210
IRDye® 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	92632211
TAP Tag Polyclonal Antibody	Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific	CAB1001
Anti-beta Actin antibody	Abcam	ab8227
Sucrose	(Merck/Sigma-Aldrich)	84097	BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (HPLC)
DL-Dithiothreitol solution	(Merck/Sigma-Aldrich)	43816	BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H₂O
Terumo Syringe 1CC/mL	Terumo Syringe	878499
Potassium chloride	(Merck/Sigma-Aldrich)	60128
HEPES	(Merck/Sigma-Aldrich)	H3375
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	12003C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium	Sigma-Aldrich	D8662
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
Tris hydrochloride	Merck/Sigma-Aldrich	10812846001
Sodium dodecyl sulfate	Merck/Sigma-Aldrich	436143
IGEPAL CA-630	Merck/Sigma-Aldrich	I3021
Rnasin Ribonuclease Inhibitor	Promega	N2111
Stainless steel grinding jar	Retsch	02.462.0059
MM400 mixer mill	Retsch	20.745.0001
Gradient Fractionator	Brandel	BRN-BR-188
Thermomixer R	Eppendorf	Z605271
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices	Eppendorf Safe-Lock	30121023
Mini Gel Tank	(Thermo Fisher Scientific)	A25977	PAGE running tank
5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm	Beckman-Coulter	344057
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm – 50Pk	Beckman-Coulter	331372
Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices	Merck	UFC5030	Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume
Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge	Cambridge Scientific	15566
Beckman Coulter Optima L-90K	GMI	8043-30-1191
Nunc EasYFlask 175cm2	Thermofisher Scientific	159910
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermofisher Scientific	14-432-22
25 mL Serological Pipette	Sigma-Aldrich	SIAL1250
10 mL Serological Pipette	Sigma-Aldrich	SIAL1100
DNA lobind tubes	Eppendorf	30108051
Cold Centrifuge 5810 R	Eppendorf	EP022628188	for 50 mL tubes
Orbital Shaking Incubator	Ratek	OM11
Frezco 17 Microcentrifuge	Thermofisher Scientific	75002402
Eppendorf DNA lo-bind tubes	Merck/Sigma-Aldrich	EP0030108051
Eppendorf® Protein LoBind tubes	Merck/Sigma-Aldrich	EP0030108116
SW 41 Ti Swinging bucket rotor	Beckman-Coulter	331362
Heracell™ 150i CO2 Incubator, 150 L	Thermofisher Scientific	51026282
0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe	BD Medical	328822
3 mL syringe with Luer Lok tip	BD Medical	302113
25 G x 16 mm Hypodermic Needle	Terumo	TUAN2516R1

Referanslar

Janapala, Y., Preiss, T., Shirokikh, N. E. Control of translation at the initiation phase during glucose starvation in yeast. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4043 (2019).
Masvidal, L., Hulea, L., Furic, L., Topisirovic, I., Larsson, O. mTOR-sensitive translation: Cleared fog reveals more trees. RNA Biology. 14 (10), 1299-1305 (2017).
Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Molecular Biology of the Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
Crawford, R. A., Pavitt, G. D. Translational regulation in response to stress in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 36 (1), 5-21 (2019).
Melamed, D., Pnueli, L., Arava, Y. Yeast translational response to high salinity: global analysis reveals regulation at multiple levels. RNA. 14 (7), 1337-1351 (2008).
Hershey, J. W., Sonenberg, N., Mathews, M. B. Principles of translational control: An overview. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 011528 (2012).
Mata, J., Marguerat, S., Bähler, J. Post-transcriptional control of gene expression: a genome-wide perspective. Trends in Biochemical Sciences. 30 (9), 506-514 (2005).
Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational regulation of gene expression during conditions of cell stress. Molecular Cell. 40 (2), 228-237 (2010).
Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 5 (3), 301-315 (2014).
Archer, S. K., Shirokikh, N. E., Beilharz, T. H., Preiss, T. Dynamics of ribosome scanning and recycling revealed by translation complex profiling. Nature. 535 (7613), 570-574 (2016).
Hinnebusch, A. G., Ivanov, I. P., Sonenberg, N. Translational control by 5′-untranslated regions of eukaryotic mRNAs. Science. 352 (6292), 1413-1416 (2016).
Dever, T. E., Green, R. The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (7), 013706 (2012).
Shirokikh, N. E., Preiss, T. Translation initiation by cap-dependent ribosome recruitment: Recent insights and open questions. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 9 (4), 1473 (2018).
Jiménez-Díaz, A., Remacha, M., Ballesta, J. P., Berlanga, J. J. Phosphorylation of initiation factor eIF2 in response to stress conditions is mediated by acidic ribosomal P1/P2 proteins in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 8 (12), 84219 (2013).
Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
Barraza, C. E., et al. The role of PKA in the translational response to heat stress in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 12 (10), 0185416 (2017).
Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: Life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
Jamar, N. H., Kritsiligkou, P., Grant, C. M. The non-stop decay mRNA surveillance pathway is required for oxidative stress tolerance. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6881-6893 (2017).
Chen, Z., et al. The complete pathway for thiosulfate utilization in Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology. 84 (22), (2018).
Marzluf, G. A. Molecular genetics of sulfur assimilation in filamentous fungi and yeast. Annual Review of Microbiology. 51, 73-96 (1997).
Miller, D., Brandt, N., Gresham, D. Systematic identification of factors mediating accelerated mRNA degradation in response to changes in environmental nitrogen. PLoS Genetics. 14 (5), 1007406 (2018).
Zhang, W., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Regulation of sensing, transportation, and catabolism of nitrogen sources in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 82 (1), (2018).
Tokpohozin, S. E., Fischer, S., Becker, T. Selection of a new Saccharomyces yeast to enhance relevant sorghum beer aroma components, higher alcohols, and esters. Food Microbiology. 83, 181-186 (2019).
Walker, G. M., Stewart, G. G. Saccharomyces cerevisiae in the production of fermented beverages. Beverages. 2 (4), 30 (2016).
Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
Jin, H. Y., Xiao, C. An integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).
Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3889-3894 (2003).
Lackner, D. H., et al. A network of multiple regulatory layers shapes gene expression in fission yeast. Molecular Cell. 26 (1), 145-155 (2007).
Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-Wide Analysis in Vivo of Translation with Nucleotide Resolution Using Ribosome Profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. Ribosome Profiling: Global Views of Translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), (2019).
Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).
Hussmann, J. A., Patchett, S., Johnson, A., Sawyer, S., Press, W. H. Understanding biases in ribosome profiling experiments reveals signatures of translation dynamics in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences Genetics. 11 (12), 1005732 (2015).
Santos, D. A., Shi, L., Tu, B. P., Weissman, J. S. Cycloheximide can distort measurements of mRNA levels and translation efficiency. Nucleic Acids Research. 47 (10), 4974-4985 (2019).
Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6 (3), 209-217 (2010).
Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: A tool for the study of chromatin complexes. Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
Kage, U., Powell, J. J., Gardiner, D. M., Kazan, K. Ribosome profiling in plants: What is not lost in translation. Journal of Experimental Botany. 71 (18), 5323-5332 (2020).
Shirokikh, N. E., Archer, S. K., Beilharz, T. H., Powell, D., Preiss, T. Translation complex profile sequencing to study the in vivo dynamics of mRNA-ribosome interactions during translation initiation, elongation and termination. Nature Protocols. 12 (4), 697-731 (2017).
Wagner, S., et al. Selective translation complex profiling reveals staged initiation and co-translational assembly of initiation factor complexes. Molecular Cell. 79 (4), 546-560 (2020).
Zlotorynski, E. Profiling ribosome dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (9), 535-535 (2016).
Sen, N. D., Gupta, N., S, K. A., Preiss, T., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Functional interplay between DEAD-box RNA helicases Ded1 and Dbp1 in preinitiation complex attachment and scanning on structured mRNAs in vivo. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8785-8806 (2019).
Zhao, J., Qin, B., Nikolay, R., Spahn, C. M. T., Zhang, G. Translatomics: The global view of translation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 20010212 (2019).
Luthe, D. S. A simple technique for the preparation and storage of sucrose gradients. Analytical Biochemistry. 135 (1), 230-232 (1983).
Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Review Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends in Biochemical Sciences. 25 (3), 99-104 (2000).
Schmiedeberg, L., Skene, P., Deaton, A., Bird, A. A Temporal Threshold for Formaldehyde Crosslinking and Fixation. PLoS One. 4 (2), 4636 (2009).
Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: A probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (19), 6470-6474 (1985).
Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping proteinDNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
Bohlen, J., Fenzl, K., Kramer, G., Bukau, B., Teleman, A. A. Selective 40S footprinting reveals cap-tethered ribosome scanning in human cells. Molecular Cell. 79 (4), 561-574 (2020).
Shirokikh, N. E. Translation complex stabilization on messenger RNA and footprint profiling to study the RNA responses and dynamics of protein biosynthesis in the cells. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. , (2021).
Giess, A., et al. Profiling of small ribosomal subunits reveals modes and regulation of translation initiation. Cell Reports. 31 (3), 107534 (2020).
Firmino, A. A. P., et al. Separation and paired proteome profiling of plant chloroplast and cytoplasmic ribosomes. Plants (Basel). 9 (7), (2020).
Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Research. 42 (17), 134 (2014).
Santos, D. A., Shi, L., Tu, B. P., Weissman, J. S. Cycloheximide can distort measurements of mRNA levels and translation efficiency. Nucleic Acids Research. 47 (10), 4974-4985 (2019).
Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6 (3), 209-217 (2010).
Plénat, F., et al. Formaldehyde fixation in the third millennium. Annales De Pathologie. 21 (1), 29-47 (2001).
Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
Wang, N. S., Minassian, H. The formaldehyde-fixed and paraffin-embedded tissues for diagnostic transmission electron microscopy: A retrospective and prospective study. Human Pathology. 18 (7), 715-727 (1987).
Grifo, J. A., et al. Characterization of eukaryotic initiation factor 4A, a protein involved in ATP-dependent binding of globin mRNA. Journal of Biological Chemistry. 257 (9), 5246-5252 (1982).
Li, Y. Commonly used tag combinations for tandem affinity purification. Biotechnology and Applied Biochemistry. 55 (2), 73-83 (2010).
Blum, S., et al. ATP hydrolysis by initiation factor 4A is required for translation initiation in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (16), 7664-7668 (1992).
Merrick, W. C. eIF4F: A Retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
Rogers, G. W., Komar, A. A., Merrick, W. C. eIF4A: The godfather of the DEAD box helicases. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 72, 307-331 (2002).

Etiketler

In Vivo Fixation Translational Complexes Eukaryotic Cells Rapid Chilling Formaldehyde Fixation Glycine Quenching Cell Lysis Ribosomal Fractions Affinity Purification RNA Analysis Mass Spectrometry Yeast Culture Exponential Growth Phase Formaldehyde Concentration Fixation Time Cell Pelleting Glycine Buffer

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Janapala, Y., Woodward, K., Lee, J., Rug, M., Preiss, T., Shirokikh, N. E. Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (178), e62639, doi:10.3791/62639 (2021).