Presentiamo una tecnica per stabilizzare rapidamente complessi traslazionali (biosintesi proteica) con reticolazione di formaldeide in cellule di lievito vivo e di mammifero. L’approccio consente di sezionare intermedi transitori e interazioni dinamiche RNA:proteina. I complessi reticolati possono essere utilizzati in molteplici applicazioni a valle come nei metodi di profilazione basati sul sequenziamento profondo, nella microscopia e nella spettrometria di massa.
Le risposte rapide che coinvolgono una rapida ridistribuzione del messaggero (m) RNA e le alterazioni della traduzione dell’mRNA sono pertinenti agli aggiustamenti omeostatici in corso delle cellule. Questi aggiustamenti sono fondamentali per la sopravvivenza delle cellule eucariotiche e il “controllo dei danni” durante i livelli fluttuanti di nutrienti e salinità, la temperatura e vari stress chimici e di radiazione. A causa della natura altamente dinamica delle risposte a livello di RNA e dell’instabilità di molti degli intermedi RNA:RNA e RNA:proteina, ottenere un’istantanea significativa dello stato dell’RNA citoplasmatico è possibile solo con un numero limitato di metodi. Gli esperimenti di tipo ribosoma a livello di trascrittoma e basati su RNA-seq sono tra le fonti di dati più informative per il controllo della traduzione. Tuttavia, l’assenza di una stabilizzazione intermedia uniforme di RNA e RNA:proteina può portare a diversi pregiudizi, in particolare nelle vie di risposta cellulare frenetiche. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato di fissazione rapida applicabile alle cellule eucariotiche di diversa permeabilità, per aiutare nella stabilizzazione intermedia di RNA e RNA: proteina. Forniamo inoltre esempi di isolamento dei complessi RNA:proteina stabilizzati in base alla loro co-sedimentazione con frazioni ribosomiali e poli(ribo)somali. Il materiale stabilizzato separato può essere successivamente utilizzato come parte di esperimenti di tipo ribosoma, come nell’approccio tcp-seq (Translation Complex Profile sequencing) e nei suoi derivati. La versatilità dei metodi in stile TCP-seq è stata ora dimostrata dalle applicazioni in una varietà di organismi e tipi di cellule. I complessi stabilizzati possono anche essere ulteriormente purificati per affinità e ripresi utilizzando la microscopia elettronica, separati in diverse frazioni poli(ribo)somali e sottoposti a sequenziamento dell’RNA, grazie alla facilità dell’inversione del reticolo. Pertanto, i metodi basati sullo snap-chilling e sulla fissazione della formaldeide, seguiti dall’arricchimento del complesso RNA:protein basato sulla sedimentazione o su un altro tipo di arricchimento del complesso RNA:protein, possono essere di particolare interesse nello studio di dettagli più fini della dinamica rapida del complesso RNA:protein nelle cellule vive.
Gli organismi viventi sono soggetti a cambiamenti dinamici intra ed extracellulari nel corso della loro vita, che richiedono risposte rapide per mantenere l’omeostasi e garantire la sopravvivenza. Per consentire l’adattamento ambientale, le cellule eucariotiche regolano il loro metabolismo attraverso il controllo dell’espressione genica. Il controllo dell’espressione genica può essere esercitato durante la trascrizione e/o la traduzione; con risposte traslazionali che si verificano generalmente più rapidamente1,2,3,4. Ad esempio, i cambiamenti traslazionali si verificano tipicamente entro 1-30 minuti dall’inizio dello stress, mentre le alterazioni a livello di trascrizione seguono ore dopo l’esposizione allo stress3,4,5. Le alterazioni della produzione di traduzione si ottengono più rapidamente a causa della persistente disponibilità di molecole di (m)RNA messaggero nel citoplasma. Viceversa, a livello di trascrizione, nuove molecole di mRNA devono essere sintetizzate, e negli eucarioti, elaborate ed esportate dal nucleo, producendo ampi ritardi nel tempo di risposta2,4,6,7,8.
La risposta traslazionale acuta allo stress è generalmente caratterizzata da una diminuzione complessiva della produzione di traduzione, con l’upregulation selettiva delle proteine necessarie per la sopravvivenza cellulare1,3,4,9. Si ritiene che la riduzione della produzione di proteine sia cruciale a causa dell’elevato costo energetico del processo3,7. Per facilitare l’inibizione selettiva e l’upregulation, le risposte traslazionali sono servite da una serie di complessi meccanismi di regolazione. La regolazione può essere esercitata in tutte le fasi della traduzione: inizio, allungamento, cessazione della biosintesi polipeptidica e riciclaggio ribosomiale10,11,12,13, ma è esposto più fortemente nella fase di iniziazione5,7,9,10,13. Durante l’inizio, la piccola subunità ribosomiale (SSU), assistita da fattori di iniziazione eucariotici (eIF), si lega e scansiona la regione 5′ non tradotta (UTR) dell’mRNA fino a quando non viene riconosciuto un codone iniziale2,5,6,8,11,12,13. I meccanismi di regolamentazione spesso prendono di mira gli eIF che influiscono sull’allegato, la scansione e il riconoscimento dei codoni di avvio. Ad esempio, il fattore di iniziazione eIF2, un fattore di traduzione essenziale che aiuta nel reclutamento di un Met-tRNA iniziatoreiMet alla SSU, è spesso mirato negli eucarioti in condizioni di stress4,6,11. Nel lievito, la fosforilazione di questo fattore può essere indotta sotto deprivazione di nutrienti e stress osmotico1,4,11,14,15, e nelle cellule di mammifero, la fame di aminoacidi, lo stress del reticolo endoplasmatico (ER), lo stress UV, l’infezione virale e i livelli di ossigeno alterati possono innescare questa risposta8,9,11. La rapida sovraregolazione della traduzione specifica dell’mRNA è evidente nella risposta delle cellule di mammifero all’ipossia, che presenta un’inibizione globale della traduzione rapida e una sovraregolazione selettiva della biosintesi dei fattori inducibili dall’ipossia (HIF). Gli HIF sono fattori di trascrizione, che poi suscitano una riprogrammazione cellulare a lungo termine a livello di trascrizione del DNA8,9,16. Risposte simili sono state osservate nel lievito sotto stress termico, con rapida espressione traslazionale di heat shock proteins (HSP) seguita da risposte ritardate a livello di trascrizione17,18. Oltre alla privazione di nutrienti e allo shock termico, le risposte traslazionali nel lievito sono state studiate sotto ossigeno variabile.8,19salinità5, fosfato, zolfo20,21 e azoto22,23 Livelli. Questa ricerca ha implicazioni diffuse per gli usi industriali del lievito, come la cottura e la fermentazione24,25. Le risposte traslazionali possono anche essere strumentali nel promuovere la comprensione di malattie come i disturbi neurodegenerativi e le malattie cardiache, che sono caratterizzate da stress intracellulari come lo stress ossidativo. Nel complesso, le risposte traslazionali sono parte integrante del controllo dell’espressione genica e facilitano un rapido adattamento a una vasta gamma di condizioni di stress negli organismi eucariotici.
Per studiare le risposte traslazionali, sono necessari metodi che forniscano istantanee minimamente distorte del panorama della traduzione. La profilazione dei polisomi è un approccio classico utilizzato nello studio della traslazione attraverso l’mRNA, che coinvolge la separazione delle frazioni poli(ribo)somali dell’mRNA tramite ultracentrifugazione attraverso gradienti di saccarosio26,27. L’approccio può essere utilizzato per esplorare i livelli di traduzione per i singoli mRNA (con i metodi di rilevamento come la trascrizione inversa e la reazione a catena della polimerasi, RT-PCR26), o globalmente in combinazione con tecniche ad alto rendimento (microarray o RNA-seq28,29). Un approccio più evoluto è la profilazione dei ribosomi, che consente lo studio delle posizioni dei ribosomi allunganti lungo una molecola di mRNA su scala genomica, nonché l’inferenza dell’efficienza della traduzione attraverso il trascrittoma e l’utilizzo dei siti di partenza principali e alternativi30,31. La profilazione dei ribosomi comporta l’isolamento e il sequenziamento di frammenti di mRNA protetti dalla presenza ribosomiale su di essi. La profilazione dei ribosomi ha fornito una notevole comprensione delle dinamiche di traduzione in una serie di condizioni, tra cui stress ipossico, shock termico e stress ossidativo31,32. La tecnica è stata adattata a più tipi di materiale di origine, tra cui lievito e cellule di mammifero.
Mentre la profilazione di polisomi e ribosomi è stata fondamentale per estendere le capacità di ricerca nella traduzione, il processo di traduzione include vari intermedi e complessi traslazionali difficili da catturare con questi metodi11,13. Un’ulteriore limitazione deriva dalla mancanza di capacità di studiare i tipi di risposta rapida, poiché i complessi traslazionali sono stabilizzati in vivo dall’aggiunta di specifici inibitori della traduzione (antibiotici), portando a determinati artefatti di distribuzione dei ribosomi, o ex vivo su lisi cellulare specificamente (antibiotici) o in modo non specifico (ioni salini o magnesio elevati), portando alla privazione degli intermedi di vita più breve o meno stabili33, 34,35.
La formaldeide è ampiamente utilizzata per reticolare acidi nucleici e proteine, come negli studi di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e immunoprecipitazione reticolante (CLIP). Le sue piccole dimensioni e l’eccellente permeabilità cellulare consentono una rapida azione in vivo 36. Basato sulla rapida reticolazione della formaldeide, l’approccio di profilazione dei ribosomi è stato esteso con il Translation Complex Profile Sequencing (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, sviluppato per la prima volta nel lievito, consente la cattura di tutti gli intermedi di traduzione, compresi i complessi SSU di scansione o post-terminazione e le configurazioni ribosomiali multiple37,38,41,42. Il metodo è stato utilizzato in diversi studi10,38,39,41,42,alcuni dei quali utilizzano un approccio combinatorio sia di inibitori della traduzione che di reticolazione della formaldeide per facilitare l’arresto della traduzione. Un’ulteriore versione modificata della tecnica, TCP-seq39selettivo, è stata recentemente impiegata per includere l’immunopurazione dei complessi reticolati, ampliando la portata delle applicazioni TCP-seq. La natura rapida, efficiente e reversibile della reticolazione della formaldeide rende questi approcci adatti allo studio di interazioni complesse transitorie tra mRNA:traduzione, in particolare nel contesto di percorsi di risposta a livello di traduzione altamente dinamici.
Qui descriviamo in dettaglio i processi di reticolazione della formaldeide in vivo ai fini della stabilizzazione e dell’isolamento completi del complesso di traduzione. Forniamo protocolli separati sfumati per le cellule di lievito e mammifero (Figura 1). Descriviamo inoltre esempi del successivo utilizzo del materiale stabilizzato con reticolazione (Figura 1), ad esempio per il rilevamento di fattori proteici co-purificati mediante immunoblotting (western-blotting), purificazione immuno-assistita (o “immunoprecipitazione”; IP) e arricchimento di complessi traslazionali contenenti specifici fattori di interesse, microscopia elettronica e sequenziamento dell’RNA.
Figura 1: Schema che illustra una panoramica della configurazione sperimentale tipica. Le fasi principali della stabilizzazione in vivo della formaldeide dei complessi traslazionali sono rappresentate come un diagramma di flusso, integrato da informazioni sugli strumenti chiave necessari. Vengono delineate le potenziali applicazioni a valle del materiale reticolato, inclusi esempi che sono stati impiegati con successo ma non direttamente coperti in questo protocollo, come la purificazione del tallone SPRI dell’RNA, il sequenziamento dell’RNA e la spettrometria di massa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La fissazione della formaldeide è un metodo conveniente e popolare per ottenere una rapida reticolazione in vivo delle biomolecole10,36,45,46,47,48. Rispetto agli altri potenziali bersagli della biomolecola, la cattura di successo dei complessi traslazionali richiede una fissazione immediata durante il raffreddamento istantaneo delle cellule o di altro materiale. Senza la stabilizzazione non ritardata, c’è un potenziale per i diversi processi relativi alla traduzione di continuare, spostando la distribuzione complessa lontano dallo stato in vivo imperturbabile 49. Rispetto agli altri metodi di arresto traslazionale e stabilizzazione del complesso ribosomiale, la rapidità dell’azione della formaldeide attraverso le membrane cellulari e la natura indiscriminata dei legami incrociati promettono la conservazione della massima diversità degli intermedi complessi di traduzione più vicini ai loro stati nativamente distribuiti50.
L’approccio qui presentato è stato stabilito e ottimizzato sia nel lievito che nelle cellule di mammifero, e i metodi sono stati ora derivati da altri gruppi per l’uso su materiale biologico più diversificato, come in vertebrati interi (ad esempio, embrioni di zebrafish)10,38,39,49,51,52 . Sebbene questi lavori rafforzino collettivamente la versatilità e l’ampia applicabilità dell’approccio, la rapida reticolazione formaldeide dei complessi traslazionali può essere considerata alquanto difficile da trasporre in nuovi tipi di materiale biologico a causa della necessità di ottimizzazioni e aggiustamenti.
Un requisito fondamentale per il successo del metodo è la ri-ottimizzazione della concentrazione della formaldeide e la tecnica di raccolta e distruzione cellulare. Le cellule di lievito meno permeabili, piccole e rotonde richiedono una concentrazione di formaldeide molto più alta (almeno 10 volte) e l’interruzione fisica delle cellule fisse. Al contrario, le cellule di mammifero aderenti grandi e appiattite in coltura possono essere facilmente sovra-fissate e richiedono una manipolazione delicata al momento della fissazione, mentre l’estrazione dei complessi fissi può essere eseguita chimicamente con interruzione della membrana utilizzando detergenti. La reticolazione insufficiente può consentire agli intermedi meno stabili o più di breve durata di dissociarsi o di fuoriuscire in uno stato successivo. L’over-crosslinking può influenzare negativamente la capacità di isolare e studiare le frazioni ribosomiali e può creare pregiudizi selettivi come l’esaurimento più profondo di complessi pesanti. Nella nostra osservazione, anche piccole alterazioni, come il tipo di cellule umane aderenti utilizzate, possono influenzare la resa dei complessi reticolati recuperati e possono richiedere una ri-ottimizzazione del regime di reticolazione. Possiamo anche anticipare che le cellule con proprietà di permeabilità sostanzialmente diverse, come le cellule vegetali, richiederanno un’ulteriore ottimizzazione estesa delle condizioni di fissazione52. Tuttavia, è difficile immaginare un tipo di materiale biologico che sarebbe del tutto incompatibile con l’approccio.
Una considerazione pertinente al protocollo di fissazione dei mammiferi è la densità e la quantità di materiale cellulare utilizzato come input. Si raccomanda di far crescere continuamente le cellule senza riseminare o altre perturbazioni per almeno 2 giorni per evitare influenze esterne sulle dinamiche di traduzione cellulare. Applicabile per la maggior parte dei tipi di cellule, ma per la maggior parte delle cellule aderenti costantemente raggiunti livelli di confluenza non superiori al 70% garantirà l’assenza di importanti effetti di inibizione del contatto che possono influenzare negativamente e imprevedibilmente i tassi di traduzione.
Un’altra caratteristica interessante, e potenzialmente conveniente, della fissazione della formaldeide derivante dalla sua reattività indiscriminata è l’effetto di stabilizzazione sui complessi traslazionali nei sistemi di tassonomia mista. I complessi batterici, e ancor più traslazionali di mitocondri, cloroplasti e diversi parassiti intracellulari, sono stati notoriamente difficili da colpire con specifici inibitori della traduzione. Al contrario, nei dati TCP-seq, le impronte mappate al mitotranscriptome sono facilmente osservabili nei dati38,39,50. Un interessante sviluppo successivo potrebbe essere l’uso dell’approccio per studiare la traduzione in intere microcomunità, come nel suolo, nell’acqua o nei campioni di intestino, dove un arresto traslazionale rapido affidabile e una stabilizzazione complessa con qualsiasi altro mezzo sarebbero problematici.
Va anche detto che per il materiale più complicato (come i tessuti duri e / o voluminosi), nulla impedisce l’uso della stabilizzazione della formaldeide immediatamente dopo la distruzione cellulare e l’omogeneizzazione del materiale. Questo approccio è già frequentemente impiegato per rimuovere il ritardo di ingresso cellulare quando si stabilizzano complessi traslazionali con specifici inibitori di piccole molecole33, 53,54,55. Dato che la fissazione della formaldeide è stata tradizionalmente utilizzata con ottimi risultati per la stabilizzazione di campioni ex vivo/in vitro in applicazioni come la microscopia elettronica45,56,57,58,possiamo aspettarci effetti ancora meno negativi in questo caso, in particolare quelli associati alla scarsa estrazione dei complessi traslazionali dalle cellule accuratamente fissate.
I nostri risultati confermano l’usabilità della rapida fissazione della formaldeide per stabilizzare complessi altamente transitori, come quelli che includono eIF4A. È interessante notare che, a differenza dei mammiferi, il lievito eIF4A è molto più debolmente associato al complesso legante il cappuccio eIF4F e, di conseguenza, ai complessi traslazionali in generale. eIF4A viene solitamente perso durante qualsiasi purificazione estensiva del materiale ribosomiale nel lievito29,59,60,61,62,63. Tuttavia, nel materiale di lievito fisso in vivo,è possibile ottenere un arricchimento affidabile di eIF4A in tutte le frazioni di complessi traslazionali in cui la sua presenza sarebbe prevista. I dati Sel-TCP-seq precedentemente pubblicati hanno dimostrato l’arricchimento di eIF2 ed eIF3 che si associano più fortemente ai ribosomi (ma hanno anche rivelato l’assemblaggio del complesso proteico co-traduzionale che si verifica transitoriamente)39. Pertanto, il metodo è adatto per il rilevamento di entrambi i costituenti attaccati più forti e più deboli dei complessi traslazionali.
Per riassumere, abbiamo presentato un approccio utile per ottenere informazioni principalmente sui cambiamenti che si verificano nella fase di inizio della traduzione e quando è richiesta una distribuzione ribosomiale minimamente perturbata sull’mRNA. È importante sottolineare che l’approccio è adatto per la stabilizzazione di componenti relativamente labili e dinamiche di complessi traslazionali, come eIF4A, e può essere utilizzato ampiamente soggetto alle necessarie ottimizzazioni. Abbiamo anche fornito prove dell’utilità della fissazione della formaldeide negli scenari di rapido cambiamento dinamico della traduzione, aprendo aree di indagine come le risposte cellulari veloci ai cambiamenti ambientali o alle condizioni di stress.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione Australian Research Council Discovery Project (DP180100111 a T.P. e N.E.S),National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 a N.E.S.) e Research Fellowship (APP1135928 a T.P.). Gli autori riconoscono le strutture di Microscopy Australia presso il Centre for Advanced Microscopy, Australian National University, una struttura finanziata dall’Università e dal governo federale.
Yeast extract | Merck, Sigma-Aldrich | 70161 | |
Peptone | Merck, Sigma-Aldrich | 70178 | |
D-Glucose (Dextrose) | Merck, Sigma-Aldrich | 49139 | |
Adenine sulphate | Amresco | 0607-50G | |
Formaldehyde solution | Merck Sigma-Aldrich | F11635-500ML | ACS reagent, 37 wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation) |
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen™ byThermo Fischer Scientific | 10777019 | |
cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | COEDTAF-RO Roche by Merck | 11873580001 | |
Magnesium chloride solution | (Merck/Sigma-Aldrich) | M1028 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution | (Merck/Sigma-Aldrich) | E7889 | |
Ambion™ RNase I, cloned, 100 U/µL | Ambion | AM2294 | |
SUPERase•In™ RNase Inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0) | (Merck/Sigma-Aldrich) | P1944-100ML | |
Dynabeads™ Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) | 11033 | |
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) | AM9740 | |
Glycogen (5 mg/ml) | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) | AM9510 | |
Ethyl alcohol, Pure | Merck; Sigma Aldrich | E7023 | |
Amersham™ Hybond® P Western blotting membranes, PVDF | Merck | GE10600023 | PVDF membrane for western blotting |
Bolt™ 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel | Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific | NW04120BOX | Protein gel |
4X Bolt™ LDS Sample Buffer | Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific | B0007 | LDS sample loading buffer |
Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Prestained Protein Standards | BioRad | 1610375 | Protein ladder |
20X Bolt™ MES SDS Running Buffer | ThermoFischer Scientific | B0002 | PAGE runninjg buffer |
Intercept® (PBS) Blocking Buffer | LI-COR | 927-70001 | Odyssey Blcoking buffer (PBS) |
IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 92632210 | |
IRDye® 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 92632211 | |
TAP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific | CAB1001 | |
Anti-beta Actin antibody | Abcam | ab8227 | |
Sucrose | (Merck/Sigma-Aldrich) | 84097 | BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (HPLC) |
DL-Dithiothreitol solution | (Merck/Sigma-Aldrich) | 43816 | BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O |
Terumo Syringe 1CC/mL | Terumo Syringe | 878499 | |
Potassium chloride | (Merck/Sigma-Aldrich) | 60128 | |
HEPES | (Merck/Sigma-Aldrich) | H3375 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | Sigma Aldrich | D5796 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium | Sigma-Aldrich | D8662 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
Tris hydrochloride | Merck/Sigma-Aldrich | 10812846001 | |
Sodium dodecyl sulfate | Merck/Sigma-Aldrich | 436143 | |
IGEPAL CA-630 | Merck/Sigma-Aldrich | I3021 | |
Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | |
Stainless steel grinding jar | Retsch | 02.462.0059 | |
MM400 mixer mill | Retsch | 20.745.0001 | |
Gradient Fractionator | Brandel | BRN-BR-188 | |
Thermomixer R | Eppendorf | Z605271 | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices | Eppendorf Safe-Lock | 30121023 | |
Mini Gel Tank | (Thermo Fisher Scientific) | A25977 | PAGE running tank |
5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | Beckman-Coulter | 344057 | |
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm – 50Pk | Beckman-Coulter | 331372 | |
Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices | Merck | UFC5030 | Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume |
Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge | Cambridge Scientific | 15566 | |
Beckman Coulter Optima L-90K | GMI | 8043-30-1191 | |
Nunc EasYFlask 175cm2 | Thermofisher Scientific | 159910 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermofisher Scientific | 14-432-22 | |
25 mL Serological Pipette | Sigma-Aldrich | SIAL1250 | |
10 mL Serological Pipette | Sigma-Aldrich | SIAL1100 | |
DNA lobind tubes | Eppendorf | 30108051 | |
Cold Centrifuge 5810 R | Eppendorf | EP022628188 | for 50 mL tubes |
Orbital Shaking Incubator | Ratek | OM11 | |
Frezco 17 Microcentrifuge | Thermofisher Scientific | 75002402 | |
Eppendorf DNA lo-bind tubes | Merck/Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
Eppendorf® Protein LoBind tubes | Merck/Sigma-Aldrich | EP0030108116 | |
SW 41 Ti Swinging bucket rotor | Beckman-Coulter | 331362 | |
Heracell™ 150i CO2 Incubator, 150 L | Thermofisher Scientific | 51026282 | |
0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe | BD Medical | 328822 | |
3 mL syringe with Luer Lok tip | BD Medical | 302113 | |
25 G x 16 mm Hypodermic Needle | Terumo | TUAN2516R1 |