L’isolement des noyaux uniques repose sur la dissociation et la perméabilisation à base de détergent de la membrane cellulaire, étapes qui nécessitent une optimisation et sont sujettes à l’introduction d’artefacts techniques. Nous démontrons un protocole sans détergent et sans enzymes pour l’isolement rapide des noyaux intacts directement à partir de tissus entiers, donnant des noyaux appropriés pour l’ARN-seq mono-noyau (snRNA-Seq) ou ATAC-seq.
Le transcriptome à haut débit et le profilage épigénome nécessitent la préparation d’une seule cellule ou d’une suspension de noyaux uniques. La préparation de la suspension avec des cellules ou des noyaux intacts implique la dissociation et la perméabilisation, des étapes qui peuvent introduire le bruit indésirable et les dommages indésirables. En particulier, certains types de cellules tels que les neurones sont difficiles à dissocier en cellules individuelles. En outre, la perméabilisation de la membrane cellulaire pour libérer des noyaux nécessite une optimisation par essais et erreurs, ce qui peut prendre du temps, de la main-d’œuvre intensive et financièrement non viable. Pour améliorer la robustesse et la reproductibilité de la préparation de l’échantillon pour le séquençage à haut débit, nous décrivons une méthode rapide d’isolement des noyaux à base d’enzymes et de noyaux sans détergent. Le protocole permet un isolement efficace des noyaux de l’ensemble du cerveau du poisson zèbre dans les 20 minutes. Les noyaux isolés présentent une morphologie nucléaire intacte et une faible propension à l’agrégat. De plus, la cytométrie du débit permet l’enrichissement des noyaux et le dégagement des débris cellulaires pour l’application en aval. Le protocole, qui devrait fonctionner sur les tissus mous et les cellules cultivées, fournit une méthode simple et accessible pour la préparation de l’échantillon qui peut être utilisée pour le profilage à haut débit, en simplifiant les étapes requises pour réussir les expériences ARN-seq et ATAC-seq.
L’ARN-seq unicellulaire (scRNA-Seq) et l’ATAC-seq sont des outils polyvalents pour étudier les systèmes biologiques complexes à résolution unicellulaire. Ils sont largement utilisés pour définir les sous-types cellulaires et les états, les réseaux génétiques et pour évaluer l’hétérogénéité cellulaire. Une condition préalable pour effectuer scRNA-seq est la préparation d’une suspension à cellule unique par dissociation tissulaire. En raison de la variation de la composition extracellulaire de la matrice et des propriétés mécaniques, les tissus individuels nécessitent l’optimisation du protocole de dissociation pour la préparation de la suspension à cellule unique.
La dissociation des tissus en cellules individuelles implique généralement un traitement avec des enzymes digestives, y compris la collagène, la dispase ou la trypsine, à 37 °C1,2,3,4. Comme les machines transcriptionnelles restent actives à 37 °C, la dissociation enzymatique peut introduire des artefacts d’expression d’ARNm et du bruit5,6. Notamment, l’incubation prolongée peut induire des gènes sensibles au stress et une réponse de choc thermique d’une manière non uniforme – conduisant à une variabilité technique dans l’expérience7.
Un autre inconvénient de générer une suspension à cellule unique est la difficulté d’obtenir des types de cellules viables et intacts avec des morphologies complexes. En particulier, les neurones, les adipocytes et les podocytes sont difficiles à isoler8,9,10,11. Par exemple, Wu et ses collègues ont démontré l’absence de podocytes glomerulaires dans les profils scRNA d’un rein de souris adulte12. Des observations non optimales similaires ont été faites concernant la récupération des neurones interconnectés à partir du tissu cérébral8,13,14. En résumé, les protocoles de dissociation peuvent introduire un biais de détection vers une plus grande dissociation des types cellulaires, conduisant à une fausse représentation de l’architecture cellulaire de l’organe.
Pour surmonter le bruit technique et le biais introduits lors de la préparation de l’échantillon dans scRNA-Seq., l’isolement et le profilage du noyau offre une alternative attrayante. Comme la morphologie nucléaire est similaire entre les différents types de cellules, l’isolement des noyaux contourne la question de l’isolement des cellules intactes et viables avec des morphologies complexes. Par exemple, Wu et ses collègues ont démontré le profilage réussi des podocytes glomerulaires avec l’ARN-Seq à noyau unique (snRNA-Seq.) d’un rein de souris adulte, qui manquait de scRNA-Seq12. Curieusement, des études comparatives entre l’ARN-seq unicellulaire et uni-noyau ont suggéré une diminution de l’induction des gènes de stress et de réponse de choc thermique avec snRNA-Seq12. Les études suggèrent en outre une forte corrélation entre les gènes détectés par les deux méthodes. Cependant, une étude récente sur les microglies humains n’a pas détecté l’activation génétique dans la maladie d’Alzheimer15. Ainsi, dans certains contextes, snRNA-Seq est une alternative appropriée pour scRNA-Seq16,17. En outre, l’isolement nucléaire peut être utilisé pour l’ATAC-Seq à cellule unique, fournissant des informations sur les régions de la chromatine ouverte dans les cellules individuelles.
Le protocole pour l’isolement des noyaux comporte trois étapes principales : i) la lyse à base de détergent de la membrane cellulaire pour libérer le noyau; ii) homogénéisation des tissus à l’aide d’un homogénéisateur Dence; et iii) l’enrichissement des noyaux et l’enlèvement des débris cellulaires à l’aide de la centrifugation de gradient ou de la cytométrie de flux18,19,20,21,22. Parmi ceux-ci, les deux premières étapes dépendent du type de tissu et doivent être empiriquement optimisées. Le détergent doux conduit à la rupture partielle de la membrane cellulaire et à la récupération inefficace des noyaux du tissu23. D’autre part, le niveau élevé de détergent et l’homogénéisation dure conduit à la rupture de la membrane nucléaire et leur perte24,25. Les noyaux rompus ont en outre tendance à s’agglutiner et à former des agrégats qui, s’ils ne sont pas enlevés, peuvent mener à des artefacts dans l’expérience de profilage en aval.
Pour contourner les problèmes liés à l’optimisation des détergents pour l’isolement des noyaux, nous introduisons un protocole pour isoler les noyaux intacts à partir d’échantillons frais à l’aide d’une méthode sans détergent et à base de colonne de spin. Le protocole donne des noyaux d’organe entier dans les 20 minutes, limitant l’induction de la transcription artefactale. Les noyaux isolés peuvent être enrichis avec facs pour les noyaux simples RNA-Seq. et ATAC-seq, fournissant une méthode simple et universelle qui permet le profilage robuste et reproductible à haut débit.
Le profilage du transcriptome et de l’épigénome à une résolution unicellulaire a révolutionné l’étude des systèmes biologiques. Les études à la résolution d’une seule cellule pour un tissu solide dépendent de la dissociation de l’organe en cellules individuelles ou noyaux. La dissociation est une procédure destructrice qui peut introduire des artefacts techniques, ce qui peut empêcher le développement d’une représentation précise du système5,6. Par exemple, la dissociation enzymatique peut nuire aux cellules morphologies complexes, telles que les neurones ou les podocytes, et peut induire l’expression de gènes de réponse au stress et aux chocs thermiques7,12. En outre, l’utilisation de détergent pendant la dissociation peut rompre la membrane nucléaire et conduire à l’agrégation23,25. Ainsi, l’optimisation de la dissociation pour obtenir une seule cellule ou une suspension de noyaux de la plus haute qualité est primordiale pour le succès des expériences de profilage à haut débit.
Ici, nous démontrons une méthode d’isolement des noyaux sans détergent et sans enzymes qui permet l’extraction de noyaux intacts du cerveau du poisson zèbre en moins de 20 minutes. Le protocole donne des noyaux avec une morphologie typique et une intégrité robuste (Figure 2). À partir d’un seul cerveau de poisson zèbre pesant 6 mg, le protocole donne un total de 60.000 noyaux déterminés par un nombre d’hémocytomètres. Les noyaux isolés peuvent être utilisés pour de multiples applications en aval, y compris le snRNA-seq, l’ATAC-seq et l’immunostaining. Les noyaux isolés peuvent inclure une contamination croisée par des fractions cytoplasmiques, en particulier à partir de composants de réticulum endoplasmique et de mitochondries. Pour les expériences de profilage à haut débit, le dégagement des débris cellulaires, en particulier les mitochondries, est fortement recommandé. La cytométrie de flux (figure 3) offre une option viable pour la purification des noyaux. Alternativement, le gradient de saccharose peut également être utilisé pour enlever des débris.
Le protocole a été testé sur la glande thyroïde de souris (données non montrées) et fournit des résultats semblables au tissu cérébral de poisson zèbre. Dans l’ensemble, le protocole fournit une méthode robuste, reproductible et universelle pour la préparation de la suspension à noyau unique, aidant à simplifier la logistique pour les expériences de profilage à haut débit.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les membres du laboratoire Dr Sabine Costagliola et Singh pour leurs commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS sous le numéro de subvention 34772792 – MISU à S.P.S.
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |