O isolamento de núcleos únicos depende da dissociação e da permeabilização baseada em detergente da membrana celular, passos que precisam de otimização e são propensos a introduzir artefatos técnicos. Demonstramos um protocolo detergente e sem enzimas para o rápido isolamento de núcleos intactos diretamente de todo o tecido, produzindo núcleos adequados para RNA-seq de núcleo único (snRNA-Seq) ou ATAC-seq.
Transcrição de alta taxa e profilamento de epigenome requer a preparação de uma única célula ou suspensão de núcleos únicos. A preparação da suspensão com células ou núcleos intactos envolve dissociação e permeabilização, etapas que podem introduzir ruído indesejado e danos indesejáveis. Particularmente, certos tipos de células, como neurônios, são desafiadores para dissociar em células individuais. Além disso, a permeabilização da membrana celular para liberação de núcleos requer otimização por tentativa e erro, o que pode ser demorado, trabalhoso intensivo e financeiramente inviável. Para aumentar a robustez e a reprodutibilidade da preparação da amostra para sequenciamento de alta produtividade, descrevemos um método rápido de isolamento de núcleos baseados em colunas sem enzimas e detergente. O protocolo permite o isolamento eficiente dos núcleos de todo o cérebro de zebrafish dentro de 20 minutos. Os núcleos isolados exibem morfologia nuclear intacta e baixa propensão a agregar. Além disso, a citometria de fluxo permite o enriquecimento dos núcleos e a liberação de detritos celulares para aplicação a jusante. O protocolo, que deve funcionar em tecidos moles e células cultivadas, fornece um método simples e acessível para a preparação de amostras que pode ser utilizado para perfis de alto rendimento, simplificando as etapas necessárias para experimentos de RNA-seq e ATAC-seq bem-sucedidos.
RNA-seq unicelular (scRNA-Seq) e ATAC-seq são ferramentas versáteis para estudar sistemas biológicos complexos em resolução unicelular. Eles são amplamente utilizados para definir subtipos e estados celulares, redes genéticas e para avaliar a heterogeneidade celular. Um pré-requisito para a realização do SCRNA-seq é a preparação de uma única suspensão celular por dissociação tecidual. Devido à variação da composição da matriz extracelular e das propriedades mecânicas, os tecidos individuais requerem otimização do protocolo de dissociação para a preparação da suspensão celular única.
A dissociação de tecidos em células únicas normalmente envolve o tratamento com enzimas digestivas, incluindo colagenase, dispase ou trippsina, a 37 °C1,,2,3,4. Como o maquinário transcricional permanece ativo a 37 °C, a dissociação enzimática pode introduzir artefatos de expressão mRNA e ruído5,6. Notavelmente, a incubação prolongada pode induzir genes responsivos ao estresse e resposta ao choque térmico de forma não uniforme – levando à variabilidade técnica no experimento7.
Outra desvantagem de gerar uma única suspensão celular é a dificuldade em obter tipos de células viáveis e intactas com morfologias complexas. Em particular, neurônios, adipócitos e podocitos são desafiadores para isolar8,,9,10,11. Por exemplo, Wu e colegas demonstraram a ausência de podocitos glomerulares em perfis de scRNA de um rim de camundongo adulto12. Observações não ocetimais semelhantes foram feitas em relação à recuperação de neurônios interconectados do tecido cerebral8,,13,14. Em suma, os protocolos de dissociação podem introduzir viés de detecção para facilitar a dissociação de tipos celulares, levando a uma deturpação da arquitetura celular do órgão.
Para superar o ruído técnico e o viés introduzidos durante a preparação da amostra em scRNA-Seq., o isolamento e o perfil do núcleo fornecem uma alternativa atraente. Como a morfologia nuclear é semelhante entre diferentes tipos de células, o isolamento dos núcleos contorna a questão de isolar células intactas e viáveis com morfologias complexas. Por exemplo, Wu e colegas demonstraram o perfil bem sucedido de podocitos glomerulares com o RNA-Seq. (snRNA-Seq.) de um rim de rato adulto, que estava faltando de scRNA-Seq12. Curiosamente, estudos comparativos entre RNA-seq unicelular e de núcleo único sugeriram uma diminuição na indução de genes de estresse e resposta ao choque térmico com snRNA-Seq12. Os estudos sugerem ainda uma alta correlação entre os genes detectados pelos dois métodos. No entanto, um estudo recente sobre microglia humana falhou em detectar ativação genética na doença de Alzheimer15. Assim, em certos contextos, o snRNA-Seq é uma alternativa adequada para o scRNA-Seq16,17. Além disso, o isolamento nuclear pode ser utilizado para atac-seq., fornecendo informações sobre as regiões de cromatina aberta dentro de células individuais.
O protocolo de isolamento dos núcleos envolve três passos principais: i) lise à base de detergente da membrana celular para liberar o núcleo; ii) homogeneização tecidual utilizando um homogeneizador do Dounce; e iii) enriquecimento dos núcleos e remoção de detritos celulares utilizando centrifugação gradiente ou citometria de fluxo18,19,,20,,21,22. Entre isso, os dois primeiros passos dependem do tipo de tecido e precisam ser otimizados empiricamente. Detergente suave leva à ruptura parcial da membrana celular e recuperação ineficiente dos núcleos do tecido23. Por outro lado, o alto nível de detergente e homogeneização dura leva à ruptura da membrana nuclear e sua perda24,25. Núcleos rompidos tendem ainda a se agrupar e formar agregados, que se não forem removidos podem levar a artefatos no experimento de perfil a jusante.
Para contornar as questões relacionadas à otimização de detergentes para isolamento de núcleos, introduzimos um protocolo para isolar núcleos intactos de amostras frescas usando um método baseado em detergente e spin-column. O protocolo produz núcleos de órgãos inteiros dentro de 20 minutos, limitando a indução da transcrição artefatoual. Os núcleos isolados podem ser enriquecidos com FACS para RNA-Seq. e ATAC-seq, fornecendo um método simples e universal que permite um perfil robusto e reprodutível de alto rendimento.
Traçar o perfil do transcriptome e do epigenome em uma resolução unicelular revolucionou o estudo dos sistemas biológicos. Estudos na resolução de uma única célula para um tecido sólido dependem da dissociação do órgão em células individuais ou núcleos. Dissociação é um procedimento destrutivo que pode introduzir artefatos técnicos, que podem impedir o desenvolvimento de uma representação precisa do sistema5,6. Por exemplo, a dissociação enzimática pode prejudicar células com morfologias complexas, como neurônios ou podocitos, e pode induzir a expressão de genes de estresse e resposta ao choque térmico7,,12. Além disso, o uso de detergente durante a dissociação pode romper a membrana nuclear e levar à agregação23,25. Assim, otimizar a dissociação para obter uma única suspensão celular ou núcleo da mais alta qualidade é primordial para o sucesso de experimentos de perfil de alto rendimento.
Aqui, demonstramos um método de isolamento de núcleos livre de detergente e enzimas que permite a extração de núcleos intactos do cérebro de zebrafish em menos de 20 minutos. O protocolo produz núcleos com morfologia típica e integridade robusta(Figura 2). De um único cérebro de zebrafish pesando 6 mg, o protocolo produz um total de 60.000 núcleos determinados por uma contagem de hemítmetros. Os núcleos isolados podem ser utilizados para múltiplas aplicações a jusante, incluindo snRNA-seq, ATAC-seq e imunostaining. Os núcleos isolados podem incluir contaminação cruzada de frações citoplasmáticas, particularmente de componentes de órticulum endoplasmático e mitocôndrias. Para experimentos de perfil de alto rendimento, a liberação de detritos celulares, particularmente mitocôndrias, é fortemente recomendada. A citometria de fluxo(Figura 3)fornece uma opção viável para purificação de núcleos. Alternativamente, o gradiente de sacarose também pode ser utilizado para a remoção de detritos.
O protocolo foi testado na glândula tireoide do camundongo (dados não mostrados) e fornece resultados semelhantes ao tecido cerebral de zebrafish. No geral, o protocolo fornece um método robusto, reprodutível e universal para a preparação de suspensão de núcleo único, ajudando a simplificar a logística para experimentos de perfil de alto rendimento.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos aos membros do laboratório Dr. Sabine Costagliola e Singh por comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS sob o número grant 34772792 – MISU to S.P.S.
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |