El aislamiento de núcleos individuales se basa en la disociación y la permeabilización basada en detergente de la membrana celular, pasos que necesitan optimización y son propensos a introducir artefactos técnicos. Demostramos un protocolo libre de detergente y enzimas para el aislamiento rápido de núcleos intactos directamente de todo el tejido, produciendo núcleos adecuados para ARN-seq de un solo núcleo (snRNA-Seq) o ATAC-seq.
El perfilado de transcriptoma y epigenoma de alto rendimiento requiere la preparación de una sola célula o una sola suspensión de núcleos. La preparación de la suspensión con células o núcleos intactos implica disociación y permeabilización, pasos que pueden introducir ruido no deseado y daños indeseables. Particularmente, ciertos tipos de células como las neuronas son difíciles de disociar en células individuales. Además, la permeabilización de la membrana celular para liberar núcleos requiere optimización por ensayo y error, que puede ser lento, laborioso y financieramente inviable. Para mejorar la robustez y reproducibilidad de la preparación de muestras para la secuenciación de alto rendimiento, describimos un método de aislamiento rápido basado en columnas y enzimas libres de detergentes. El protocolo permite un aislamiento eficiente de los núcleos de todo el cerebro de pez cebra en 20 minutos. Los núcleos aislados muestran morfología nuclear intacta y baja propensión a agregar. Además, la citometría de flujo permite el enriquecimiento de núcleos y el aclaramiento de desechos celulares para su aplicación posterior. El protocolo, que debe funcionar en tejidos blandos y células cultivadas, proporciona un método simple y accesible para la preparación de muestras que se puede utilizar para la elaboración de perfiles de alto rendimiento, simplificando los pasos necesarios para experimentos exitosos de ARN-seq y ATAC-seq de un solo núcleo.
El ARN-seq de una sola célula (scRNA-Seq) y el ATAC-seq son herramientas versátiles para estudiar sistemas biológicos complejos con resolución de una sola célula. Se utilizan ampliamente para definir subtipos y estados celulares, redes genéticas y para evaluar la heterogeneidad celular. Un requisito previo para realizar scRNA-seq es la preparación de una suspensión de una sola célula por disociación tisular. Debido a la variación en la composición de la matriz extracelular y las propiedades mecánicas, los tejidos individuales requieren la optimización del protocolo de disociación para la preparación de la suspensión de una sola célula.
La disociación de los tejidos en células individuales suele implicar el tratamiento con enzimas digestivas, incluyendo colagenasa, dispase o tripsina, a 37 oC1,2,3,4. Dado que la maquinaria transcripcional permanece activa a 37oC, la disociación enzimática puede introducir artefactos de expresión de ARNm y ruido5,,6. En particular, la incubación prolongada puede inducir genes sensibles al estrés y respuesta de choque térmico de una manera no uniforme, lo que conduce a una variabilidad técnica en el experimento7.
Otro inconveniente de generar una suspensión de una sola célula es la dificultad para obtener tipos de células viables e intactos con morfologías complejas. En particular, las neuronas, adipocitos y podocitos son un reto para aislar8,9,10,11. Por ejemplo, Wu y sus colegas demostraron la ausencia de podocitos glomerulares en los perfiles de SCRNA de un riñón de ratón adulto12. Observaciones no óptimas similares se han realizado con respecto a la recuperación de neuronas interconectadas del tejido cerebral8,13,14. En resumen, los protocolos de disociación pueden introducir sesgo de detección hacia tipos de células más fáciles de disociar, lo que conduce a una tergiversación de la arquitectura celular del órgano.
Para superar el ruido técnico y el sesgo introducido durante la preparación de la muestra en scRNA-Seq., el aislamiento y el perfilado del núcleo proporciona una alternativa atractiva. Como la morfología nuclear es similar entre los diferentes tipos de células, el aislamiento de los núcleos elude el problema de aislar las células intactas y viables con morfologías complejas. Por ejemplo, Wu y sus colegas demostraron un perfil exitoso de podocitos glomerulares con el ARN-Seq. (snRNA-Seq. de un riñón de ratón adulto, que faltaba en scRNA-Seq12. Intrigantemente, los estudios comparativos entre el ARN-seq de una célula y el RNA-seq de un solo núcleo han sugerido una disminución en la inducción de los genes de respuesta al estrés y al choque térmico con arn ARN-Seq12. Los estudios sugieren además una alta correlación entre los genes detectados por los dos métodos. Sin embargo, un estudio reciente sobre la microglia humana no detectó la activación genética en la enfermedad de Alzheimer15. Por lo tanto, en ciertos contextos, snRNA-Seq es una alternativa adecuada para scRNA-Seq16,17. Además, el aislamiento nuclear se puede utilizar para ATAC-Seq de una sola célula, proporcionando información sobre las regiones de cromatina abierta dentro de células individuales.
El protocolo para el aislamiento de núcleos implica tres pasos principales: i) la lelisis a base de detergente de la membrana celular para liberar el núcleo; ii) homogeneización del tejido utilizando un homogeneizador Dounce; y iii) enriquecimiento de núcleos y eliminación de residuos celulares utilizando centrifugación de gradiente o citometría de flujo18,19,20,21,22. Entre esto, los dos primeros pasos dependen del tipo de tejido y necesitan ser optimizados empíricamente. El detergente suave conduce a la ruptura parcial de la membrana celular y a la recuperación ineficiente de los núcleos del tejido23. Por otro lado, el alto nivel de detergente y la homogeneización dura conduce a la ruptura de la membrana nuclear y su pérdida24,25. Los núcleos rotos tienden aún más a agruparse y formar agregados, que si no se eliminan pueden conducir a artefactos en el experimento de generación de perfiles aguas abajo.
Para evitar los problemas relacionados con la optimización del detergente para el aislamiento de núcleos, introducimos un protocolo para aislar los núcleos intactos de muestras frescas utilizando un método sin detergente y basado en columnas de espín. El protocolo produce núcleos de todo el órgano en 20 minutos, lo que limita la inducción de la transcripción artefacto. Los núcleos aislados se pueden enriquecer con FACS para ARN-Seq. y ATAC-seq de un solo núcleo, proporcionando un método simple y universal que permite un perfilado de alto rendimiento robusto y reproducible.
El perfilado del transcriptoma y el epigenoma con una resolución monocélula ha revolucionado el estudio de los sistemas biológicos. Los estudios a la resolución de una sola célula para un tejido sólido dependen de la disociación del órgano en células individuales o núcleos. La disociación es un procedimiento destructivo que puede introducir artefactos técnicos, que pueden impedir el desarrollo de una representación precisa del sistema5,,6. Por ejemplo, la disociación enzimática puede dañar las células con morfologías complejas, como neuronas o podocitos, y puede inducir la expresión de los genes de respuesta de estrés y choque térmico7,,12. Además, el uso de detergente durante la disociación puede romper la membrana nuclear y conducir a la agregación23,,25. Por lo tanto, la optimización de la disociación para obtener una suspensión de una sola célula o núcleos de la más alta calidad es primordial para el éxito de los experimentos de perfilado de alto rendimiento.
Aquí, demostramos un método de aislamiento de detergente y núcleos libres de enzimas que permite la extracción de núcleos intactos del cerebro de pez cebra en menos de 20 minutos. El protocolo produce núcleos con morfología típica e integridad robusta(Figura 2). A partir de un solo cerebro de pez cebra con un peso de 6 mg, el protocolo produce un total de 60.000 núcleos determinados por un recuento de hemocitoómetros. Los núcleos aislados se pueden utilizar para múltiples aplicaciones aguas abajo, incluyendo snRNA-seq, ATAC-seq e inmunostaining. Los núcleos aislados pueden incluir contaminación cruzada de fracciones citoplasmáticas, particularmente de componentes de retículo endoplasmático y mitocondrias. Para experimentos de perfilado de alto rendimiento, se recomienda encarecidamente el aclaramiento de desechos celulares, particularmente las mitocondrias. La citometría de flujo (Figura 3) proporciona una opción viable para la purificación de núcleos. Alternativamente, el gradiente de sacarosa también se puede utilizar para la eliminación de escombros.
El protocolo se ha probado en la glándula tiroides del ratón (datos no mostrados) y proporciona resultados similares al tejido cerebral del pez cebra. En general, el protocolo proporciona un método robusto, reproducible y universal para la preparación de la suspensión de un solo núcleo, lo que ayuda a simplificar la logística para experimentos de generación de perfiles de alto rendimiento.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los miembros del laboratorio Dr. Sabine Costagliola y Singh por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS bajo la Subvención número 34772792 – MISU a S.P.S.
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |