단일 핵 절연은 세포막의 해리 및 세제 기반 과구화에 의존하며 최적화가 필요하며 기술 적 유물을 도입하는 경향이있는 단계입니다. 당사는 전체 조직에서 직접 그대로 핵을 신속하게 분리하기 위한 세제 및 효소 없는 프로토콜을 시연하여 단일 핵 RNA-seq(snRNA-Seq) 또는 ATAC-seq에 적합한 핵을 산출합니다.
고처리량 전사체 및 후성 유전체 프로파일링은 단일 세포 또는 단일 핵 현탁액의 준비를 필요로 한다. 그대로 세포 또는 핵을 가진 현탁액의 준비는 해리와 투과화를 포함, 원치 않는 소음과 바람직하지 않은 손상을 소개 할 수있는 단계. 특히, 뉴런과 같은 특정 세포 유형은 개별 세포로 해리하기가 어렵습니다. 추가적으로, 핵을 방출하기 위하여 세포 막의 투과화는 시간 소모, 노동 집약적이고 재정적으로 실행 가능할 수 있는 시행 착오에 의하여 최적화를 요구합니다. 고처리량 시퀀싱을 위한 시료 제제의 견고성과 재현성을 향상시키기 위해 신속한 효소와 세제 없는 컬럼 기반 핵 분리 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 20분 이내에 전체 제브라피시 뇌에서 핵을 효율적으로 분리할 수 있게 해줍니다. 고립 된 핵은 핵 형태와 골재에 대한 낮은 성향을 그대로 표시합니다. 또한, 유동 세포측정은 다운스트림 적용을 위한 세포 이물질의 핵 농축 및 클리어런스를 허용한다. 연조직 및 배양 세포에서 작동해야 하는 이 프로토콜은 고처리량 프로파일링에 활용할 수 있는 샘플 준비를 위한 간단하고 접근 가능한 방법을 제공하여 성공적인 단일 핵 RNA-seq 및 ATAC-seq 실험에 필요한 단계를 단순화합니다.
단세포 RNA-seq(scRNA-Seq) 및 ATAC-seq는 단일 세포 해상도에서 복잡한 생물학적 시스템을 연구하는 다목적 도구입니다. 그(것)들은 세포 특수형 및 상태, 유전자 네트워크를 정의하고 세포 이질성을 평가하기 위하여 널리 이용됩니다. scRNA-seq를 수행하기 위한 전제 조건은 조직 해리에 의한 단일 세포 현탁액의 제조이다. 세포외 매트릭스 조성 및 기계적 특성의 변화로 인해 개별 조직은 단일 세포 서스펜션의 준비를 위해 해리 프로토콜의 최적화가 필요합니다.
단일 세포로 조직의 해리는 전형적으로 콜라게나아제, 디스파제 또는 트립신을 포함한 소화 효소를 가진 치료를 37°C1,,2,,3,,4에서포함한다. 전사 기계는 37 °C에서 활성 상태로 유지되므로 효소 해리는 mRNA 발현 아티팩트 및 노이즈5,,6을소개 할 수 있습니다. 특히, 장기간의 인큐베이션은 비균일한 방식으로 스트레스 반응성 유전자 및 열 충격 반응을 유도할 수 있으며, 실험7에서기술적 가변성을 유발할 수 있다.
단일 세포 현탁액생성의 또 다른 단점은 복잡한 형태학을 가진 실행 가능하고 그대로 셀 유형을 얻는 데 어려움이 있다는 것입니다. 특히, 뉴런, 지방세포 및 세포세포는8,9,,10,,11을분리하기 어렵다., 예를 들어, 우와 동료들은 성인 마우스 신장 12에서 scRNA 프로필에 구엽 포도세포의 부재를입증했다. 유사한 비최적 관찰은 뇌 조직8,,13,14에서상호 연결된 뉴런의회복에관한 것으로 만들어졌다. 요약하자기 프로토콜은 세포 유형을 쉽게 분리하기 위해 검출 편향을 도입하여 장기의 세포 아키텍처를 허위진술할 수 있습니다.
scRNA-Seq.에서 시료 준비 중에 도입된 기술적 소음과 편견을 극복하기 위해 핵을 격리하고 프로파일링하면 매력적인 대안을 제공합니다. 핵 형태는 다른 세포 유형 사이에서 유사하기 때문에 핵의 분리는 복잡한 형태를 가진 그대로 및 실행 가능한 세포를 격리하는 문제를 우회합니다. 예를 들어, 우와 동료들은 scRNA-Seq12에서누락된 성인 마우스 신장의 단일 핵 RNA-Seq.(snRNA-Seq.)를 가진 구엽 포도세포의 성공적인 프로파일링을 시연하였다. 흥미롭게도, 단세포와 단핵 RNA-seq 사이 비교 연구 결과는 snRNA-Seq12를가진 긴장 및 열 충격 반응 유전자의 유도에 있는 감소를 건의했습니다. 연구 결과는 또한 2개의 방법에 의해 검출된 유전자 사이 높은 상관관계를 건의합니다. 그러나, 인간 microglia에 대한 최근 연구는 알츠하이머 병15에서유전 활성화를 검출하지 못했습니다. 따라서 특정 맥락에서, snRNA-Seq는 scRNA-Seq16,,17에적합한 대안이다. 또한, 핵 절연은 단세포 ATAC-Seq.에 활용될 수 있으며, 개별 세포 내의 개방 크로마틴 영역에 대한 정보를 제공한다.
핵 분리를 위한 프로토콜은 3개의 중요한 단계를 관련시킵니다: i) 핵을 풀어 놓기 위하여 세포막의 세제 기지를 둔 용해; ii) Dounce 균질화제를 사용하여 조직 균질화; iii) 그라데이션 원심분리 또는,유동 세포측정법(18,19,18,20,21,,22)을이용한 세포이물질의 농축 및 제거., 이 중, 처음 두 단계는 조직 유형에 따라 달라 지적으로 최적화 될 필요가있다. 온화한 세제는 세포막의 부분파열과조직(23)으로부터핵의비효율적인 회수로 이어집니다. 한편, 높은 수준의 세제와 가혹한 균질화는 핵막의 파열과 그들의 손실24,,25로이어집니다. 파열된 핵은 더 뭉쳐서 골재를 형성하는 경향이 있으며, 제거되지 않으면 다운스트림 프로파일링 실험에서 유물로 이어질 수 있습니다.
핵 분리를 위한 세제 최적화와 관련된 문제점을 회피하기 위해 세제 프리 및 스핀 컬럼 기반 방법을 사용하여 신선한 시료로부터 그대로 핵을 분리하는 프로토콜을 도입합니다. 프로토콜은 20 분 이내에 전체 기관에서 핵을 산출하여 관절 전사의 유도를 제한합니다. 절연 된 핵은 단일 핵 RNA-Seq 및 ATAC-seq를 위해 FACS로 농축 될 수 있으며 견고하고 재현 가능한 고처리량 프로파일링을 가능하게하는 간단하고 보편적 인 방법을 제공합니다.
단일 세포 해상도에서 전사체와 후성 유전체를 프로파일링하는 것은 생물학적 시스템의 연구에 혁명을 일으켰습니다. 고체 조직을 위한 단 하나 세포의 해상도에 연구 개별적인 세포 또는 핵으로 기관의 해리에 달려 있습니다. 해리는 시스템5,,6의정확한 표현의 개발을 방지 할 수있는 기술 유물을 소개 할 수있는 파괴적인 절차입니다. 예를 들어, 효소 해리는 뉴런이나 포도세포와 같은 복잡한 형태를 가진 세포에 해를 끼칠 수 있으며, 스트레스 및 열 충격 반응 유전자7,,12의발현을 유도할 수 있다. 또한, 해리 시 세제를 사용하면 핵막을 파열시키고응집(23,,25)으로이어질 수 있다. 따라서, 최고 품질의 단일 세포 또는 핵 현탁액을 얻기 위해 해리를 최적화하는 것이 고처리량 프로파일링 실험의 성공에 가장 중요하다.
여기서는 20분 이내에 제브라피시 뇌에서 온전한 핵을 추출할 수 있는 세제 및 효소없는 핵 분리 방법을 시연합니다. 프로토콜은 전형적인 형태와 견고한 무결성으로 핵을 산출한다(그림2). 6 mg의 단일 제브라피쉬 뇌에서, 프로토콜은 혈류계 수에 의해 결정된 총 60,000개의 핵을 산출합니다. 절연 된 핵은 snRNA-seq, ATAC-seq 및 면역 스테인닝을 포함한 여러 다운스트림 응용 프로그램에 활용 될 수있다. 상기 분리된 핵은 세포질 분획에서 교차 오염을 포함할 수 있고, 특히 내피성 망상및 미토콘드리아의 성분으로부터 포함될 수 있다. 높은 처리량 프로파일링 실험의 경우 세포 이물질, 특히 미토콘드리아의 간격이 강력히 권장됩니다. 유동 세포측정(도3)은핵의 정제를 위한 실행 가능한 옵션을 제공한다. 또는, 자당 그라데이션은 또한 이물질의 제거를 위해 이용될 수 있다.
프로토콜은 마우스 갑상선 (표시되지 않은 데이터)에서 테스트되었으며 제브라피시 뇌 조직과 유사한 결과를 제공합니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 단일 핵 서스펜션을 준비하기 위한 견고하고 재현 가능한 보편적 인 방법을 제공하여 고처리량 프로파일링 실험을위한 물류를 단순화하는 데 도움이됩니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 원고에 대한 의견에 대한 박사 사빈 코스타글리올라와 싱 연구소의 구성원에게 감사드립니다. 이 작품은 그랜트 번호 34772792에서 퐁드 드 라 레체쉬 시엔티피크 -FNRS에 의해 지원되었다 – S.P.S.에 MISU.
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |