Изоляция одноядерных тел опирается на диссоциацию и пермяцию на основе моющих средств, шаги, которые нуждаются в оптимизации и склонны к внедрению технических артефактов. Мы демонстрируем моющее средство и протокол, свободный от ферментов, для быстрой изоляции нетронутых ядер непосредственно из целых тканей, что дает ядра, пригодные для одноядерного РНК-сек (snRNA-Seq) или ATAC-seq.
Профилирование с высокой пропускной способностью и эпигеномом требует подготовки одной клетки или одноядерной подвески. Подготовка подвески с неповрежденными клетками или ядрами включает в себя диссоциацию и пермякацию, шаги, которые могут ввести нежелательный шум и нежелательные повреждения. В частности, некоторые типы клеток, такие как нейроны являются сложными для разобщенности в отдельных клетках. Кроме того, permeabilization клеточной мембраны для выпуска ядер требует оптимизации путем проб и ошибок, которые могут быть трудоемкими, трудоемким и финансово нежизнеспособным. Для повышения надежности и воспроизводимости подготовки образца для секвенирования высокой пропускной способности мы описываем быстрый метод изоляции основных столбцов на основе ферментов. Протокол позволяет эффективно изолировать ядра от всего мозга зебры в течение 20 минут. Изолированные ядра отображают неповрежденную ядерную морфологию и низкую склонность к агрегированию. Кроме того, цитометрия потока позволяет нуклеи обогащения и очистки клеточного мусора для вниз по течению применения. Протокол, который должен работать на мягких тканях и культивируемых клетках, обеспечивает простой и доступный метод для подготовки образца, который может быть использован для высокопроизводительного профилирования, упрощая шаги, необходимые для успешных экспериментов с одноядерной РНК-сек и ATAC-seq.
Одноклеточные РНК-сек (scRNA-Seq) и ATAC-seq являются универсальными инструментами для изучения сложных биологических систем с одноклеточным разрешением. Они широко используются для определения подтипов и состояний клеток, генных сетей и оценки клеточной неоднородности. Предпосылкой для выполнения scRNA-seq является подготовка одноклеточной подвески путем диссоциации тканей. В связи с изменением внеклеточного матричного состава и механических свойств, отдельные ткани требуют оптимизации диссоциационного протокола для подготовки одноклеточной подвески.
Диссоциация тканей в одиночные клетки обычно включает в себя лечение пищеварительными ферментами, включая коллагеназу, диспазу или трипсин, при 37 градусах по Цельсию1,,2,,3,4. Поскольку транскрипционная техника остается активной при 37 градусах Цельсия, ферментальная диссоциация может ввести артефакты экспрессии мРНК и шум5,6. Примечательно, что длительная инкубация может вызвать стресс отзывчивые гены и тепло-шоковую реакцию в несенсуативной манере , что приводит к технической изменчивости в эксперименте7.
Еще одним недостатком генерации одной клеточной подвески является трудность в получении жизнеспособных и нетронутых типов клеток со сложными морфологиями. В частности, нейроны, адипоциты и подоциты сложно изолировать8,,9,,10,11. Например, Ву и его коллеги продемонстрировали отсутствие гломерулярных подоцитов в профилях скрРНК от почки для взрослых мышей12. Аналогичные неоптимальные наблюдения были сделаны в отношении восстановления взаимосвязанных нейронов из ткани мозга8,,13,14. В целом, протоколы диссоциации могут привести к смещению обнаружения к более легкому рассечению к типам клеток, что приводит к искажению клеточной архитектуры органа.
Для преодоления технического шума и смещения, введенных при подготовке образца в scRNA-Seq., изоляция и профилирование ядра является привлекательной альтернативой. Поскольку ядерная морфология аналогична между различными типами клеток, изоляция ядер обходит вопрос об изоляции нетронутых и жизнеспособных клеток со сложными морфологиями. Например, Ву и его коллеги продемонстрировали успешное профилирование гломерулярных подоцитов с однофренчатой РНК-сек. (snRNA-Seq.) почки взрослой мыши, которая отсутствовала в scRNA-Seq12. Интересно, что сравнительные исследования между одноклеточными и одноядрными РНК-сек предложили снижение индукции стрессов и генов теплового шока с snRNA-Seq12. Исследования также показывают высокую корреляцию между генами, обнаруженными этими двумя методами. Тем не менее, недавнее исследование микроглии человека не удалось обнаружить генетическую активацию при болезни Альцгеймера15. Таким образом, в определенных контекстах, snRNA-Seq является подходящей альтернативой для scRNA-Seq16,17. Кроме того, ядерная изоляция может быть использована для одноклеточного ATAC-Seq., предоставляя информацию о регионах открытого хроматина в отдельных клетках.
Протокол изоляции ядер включает в себя три основных шага: i) лизис на основе моющих средств клеточной мембраны для высвобождения ядра; ii) гомогенизация тканей с помощью гомогенизатора Dounce; и iii) обогащение ядер и удаление клеточного мусора с использованием градиентной центрифугации или цитометрии потока18,,19,,20,,21,,22. Среди них первые два шага зависят от типа ткани и должны быть эмпирически оптимизированы. Мягкое моющее средство приводит к частичному разрыву клеточной мембраны и неэффективному извлечению ядер из ткани23. С другой стороны, высокий уровень моющего средства и жесткая гомогенизация приводит к разрыву ядерной мембраны и их потере24,,25. Разорванные ядра далее имеют тенденцию слипаться и формировать агрегаты, которые, если их не удалить, могут привести к артефактам в эксперименте по профилированию ниже по течению.
Чтобы обойти проблемы, связанные с оптимизацией моющих средств для изоляции ядер, мы вводим протокол для изоляции нетронутых ядер из свежих образцов с использованием метода, свободного от моющих средств и спин-колонки. Протокол дает ядра от всего органа в течение 20 минут, ограничивая индукцию артефактной транскрипции. Изолированные ядра могут быть обогащены FACS для одноядерных РНК-сек. и ATAC-seq, обеспечивая простой и универсальный метод, который позволяет надежное и воспроизводимое высокопроизводительное профилирование.
Профилирование транскриптома и эпигенома при одноклеточном разрешении произвело революцию в изучении биологических систем. Исследования по разрешению одной клетки для твердой ткани зависят от диссоциации органа в отдельные клетки или ядра. Диссоциация является разрушительной процедурой, которая может ввести технические артефакты, которые могут помешать разработке точного представления системы5,,6. Например, ферментатическая диссоциация может нанести вред клеткам со сложными морфологиями, такими как нейроны или подоциты, и может вызвать экспрессию гена реакции на стресс и тепло-шок7,,12. Кроме того, использование моющего средства во время диссоциации может разорвать ядерную мембрану и привести к агрегации23,,25. Таким образом, оптимизация диссоциации для получения одной клетки или ядер подвески самого высокого качества имеет первостепенное значение для успеха высокопроизводительных экспериментов профилирования.
Здесь мы демонстрируем метод изоляции моющих средств и без ферментов, который позволяет извлечь нетронутые ядра из мозга зебры менее чем за 20 минут. Протокол дает ядра с типичной морфологией и надежной целостностью(рисунок 2). Из одного мозга зебры весом 6 мг, протокол дает в общей сложности 60000 ядер определяется гемоцитометра кол. Изолированные ядра могут быть использованы для нескольких приложений вниз по течению, в том числе snRNA-seq, ATAC-seq и иммуносхемы. Изолированные ядра могут включать перекрестное загрязнение от цитоплазматических фракций, особенно от компонентов эндоплазмического ретикулума и митохондрий. Для экспериментов по профилированию с высокой пропускной способностью настоятельно рекомендуется расчистка клеточного мусора, особенно митохондрий. Цитометрия потока(рисунок 3) обеспечивает жизнеспособный вариант для очищения ядер. Кроме того, градиент сахарозы может также использоваться для удаления мусора.
Протокол был протестирован на щитовидной железе мыши (данные не показаны) и дает результаты, аналогичные ткани мозга зебры. В целом, протокол обеспечивает надежный, воспроизводимый и универсальный метод подготовки однофочную подвеску, помогая упростить логистику для экспериментов по профилированию высокой пропускной способности.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим членов лаборатории доктора Сабины Костаглиоли и Сингха за комментарии по поводу рукописи. Эта работа была поддержана Фондом наукоемки-FNRS при Гранте No 34772792 – MISU к S.P.S.
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |