تعتمد العزلة أحادية النوى على التحلل والتحلل القائم على المنظفات لغشاء الخلية ، وهي خطوات تحتاج إلى التحسين وعرضة لإدخال التحف الفنية. نحن نبرهن على بروتوكول المنظفات والخالية من الإنزيمات من أجل العزل السريع للنيات سليمة مباشرة من الأنسجة كلها، مما يؤدي إلى نواة مناسبة للنواة واحدة RNA-seq (snRNA-SEQ) أو ATAC-seq.
يتطلب النسخ الصوتي عالي الإنتاجية والتنميط epigenome إعداد خلية واحدة أو تعليق نوات واحدة. إعداد التعليق مع خلية سليمة أو نوى ينطوي على التفكك و Permeabilization، والخطوات التي يمكن أن تؤدي إلى الضوضاء غير المرغوب فيها والضرر غير المرغوب فيه. خاصة, بعض أنواع الخلايا مثل الخلايا العصبية هي صعبة للتفكك في الخلايا الفردية. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب تحقيق الغشاء الخلوي لإطلاق نوى التحسين من خلال التجربة والخطأ، والتي يمكن أن تكون مضيعة للوقت، والعمالة المكثفة وغير قابلة للحياة ماليا. لتعزيز قوة و قابلية إعادة إنتاج إعداد العينة لتسلسل عالي الإنتاجية، فإننا نصف أسلوب عزل سريع للأنزيم والمنظفات القائمة على الأعمدة. البروتوكول تمكن من عزل فعال للنيات من الدماغ حمار وحشي كامل في غضون 20 دقيقة. تعرض النوى المعزولة مورفولوجيا نووية سليمة وميلاً منخفضاً إلى التراكم. وعلاوة على ذلك، يسمح تدفق الخلايا إثراء الخلايا وإزالة الحطام الخلوية لتطبيق المصب. ويوفر البروتوكول، الذي ينبغي أن يعمل على الأنسجة الرخوة والخلايا المستزرعة، طريقة بسيطة وسهلة الاستخدام لإعداد العينات يمكن استخدامها في تحديد سمات عالية الإنتاجية، وتبسيط الخطوات المطلوبة لنجاح التجارب أحادية النوى RNA-seq و ATAC-seq.
رنا- سكين أحادي الخلية (SCRNA-SEQ) و ATAC-seq هي أدوات متعددة الاستخدامات لدراسة الأنظمة البيولوجية المعقدة بدقة خلية واحدة. وتستخدم على نطاق واسع لتحديد الأنواع الفرعية للخلية والدول، والشبكات الجينية، وتقييم التغاير الخلوي. شرط أساسي لأداء scRNA-seq هو إعداد تعليق خلية واحدة عن طريق تفكك الأنسجة. بسبب الاختلاف في تكوين المصفوفة خارج الخلية والخواص الميكانيكية ، تتطلب الأنسجة الفردية تحسين بروتوكول الانفصام لإعداد تعليق الخلية المفردة.
تفكك الأنسجة في خلايا مفردة عادة ما ينطوي على العلاج مع الإنزيمات الهضمية، بما في ذلك الكولاجين، dispase أو التربسين، في 37 درجة مئوية1،,2،,3،,4. كما آلات النسخ لا تزال نشطة في 37 درجة مئوية، يمكن للانفصام الأنزيمي إدخال التحف التعبير مرنا والضوضاء5،6. وتجدر الإشارة إلى أن الحضانة المطولة يمكن أن تحفز الجينات استجابة الإجهاد والاستجابة لصدمة الحرارة بطريقة غير موحدة – مما يؤدي إلى التقلبات التقنية في التجربة7.
عيب آخر من توليد تعليق خلية واحدة هو صعوبة في الحصول على خلايا قابلة للحياة وسليمة أنواع مع morphologies معقدة. على وجه الخصوص، والخلايا العصبية، adipocytes وpodocytes تشكل تحديا لعزل8،9،10،11. على سبيل المثال، أظهر وو وزملاؤه غياب podocytes الكبيبية في ملفات تعريف scRNA من كلية فأرة بالغة12. وقد أجريت ملاحظات غير الأمثل مماثلة فيما يتعلق باستعادة الخلايا العصبية المترابطة من أنسجة المخ8,13,14. باختصار ، يمكن أن تؤدي بروتوكولات الانفصام إلى إدخال التحيز للكشف عن أسهل في فصل أنواع الخلايا ، مما يؤدي إلى تحريف البنية الخلوية للجهاز.
للتغلب على الضوضاء التقنية والتحيز المقدمة خلال إعداد العينة في SCRNA-Seq.، يوفر عزل وتوصيف النواة بديلا جذابا. وبما أن المورفولوجيا النووية متشابهة بين أنواع الخلايا المختلفة، فإن عزل النواة يتحايل على مسألة عزل الخلايا السليمة والقابلة للحياة مع أنواع المورفورولوجيا المعقدة. على سبيل المثال، أظهر وو وزملاؤه التنميط الناجح للكبوسيات الكبيبية مع نواة واحدة RNA-Seq. (snRNA-Seq.) من كلية فأرة بالغة، والتي كانت مفقودة من scRNA-SEQ12. ومن المثير للاهتمام أن الدراسات المقارنة بين الخلية الواحدة والنواة الواحدة RNA-seq قد اقترحت انخفاضًا في تحريض جينات الاستجابة للإجهاد والصدمة الحرارية مع snRNA-SEQ12. وتشير الدراسات كذلك إلى وجود ارتباط كبير بين الجينات التي تم اكتشافها من خلال الطريقتين. ومع ذلك، فشلت دراسة حديثة على ميكروجليا الإنسان للكشف عن التنشيط الوراثي في مرض الزهايمر15. وهكذا في سياقات معينة، snRNA-Seq هو بديل مناسب لSnRNA-SEQ16،17. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام العزلة النووية لـ ATAC-Seq أحادي الخلية، مما يوفر معلومات عن مناطق الكروماتين المفتوح داخل الخلايا الفردية.
بروتوكول عزل النوى ينطوي على ثلاث خطوات رئيسية: 1) التحلل القائم على المنظفات من غشاء الخلية لإطلاق النواة; 2) تجانس الأنسجة باستخدام التجانس Dounce؛ و3) إثراء النوى وإزالة حطام الخلية باستخدام الطرد المركزي التدرج أو تدفق18،19،20،21،22. من بين هذا, أول خطوتين تعتمد على نوع الأنسجة وتحتاج إلى أن تكون الأمثل تجريبيا. المنظفات الخفيفة يؤدي إلى تمزق جزئي في غشاء الخلية واسترجاع غير فعال من النوى من الأنسجة23. من ناحية أخرى ، وارتفاع مستوى المنظفات والتجانس القاسي يؤدي إلى تمزق الغشاء النووي وفقدانها24،25. تمزق النوى تميل كذلك إلى تكتل معا وتشكيل المجاميع، والتي إذا لم تتم إزالتها يمكن أن يؤدي إلى القطع الأثرية في تجربة التنميط المصب.
للتحايل على القضايا المتعلقة بتحسين المنظفات لعزل النوى ، نقدم بروتوكولًا لعزل النوى السليمة عن العينات الطازجة باستخدام طريقة خالية من المنظفات والقائمة على العمود الدوار. البروتوكول تسفر عن نواة من الجهاز كله في غضون 20 دقيقة ، والحد من تحريض النسخ artifactual. ويمكن إثراء النوى المعزولة باستخدام FACS للنيوية الواحدة RNA-SEQ و ATAC-seq، مما يوفر طريقة بسيطة وعالمية تمكن من التنميط القوي والقابل للاستنساخ عالي الإنتاجية.
وقد أحدث تحديد ملامح النسخ و الخاتمة في حل خلية واحدة ثورة في دراسة النظم البيولوجية. تعتمد الدراسات على تحليل خلية واحدة للأنسجة الصلبة على تفكك الجهاز في خلايا فردية أو نوات. الانفصام هو إجراء مدمر يمكن أن يدخل التحف الفنية، والتي يمكن أن تمنع تطوير تمثيل دقيق للنظام5،6. على سبيل المثال، يمكن أن يضر الانفصام الأنزيمي الخلايا ذات المورولوجي المعقدة، مثل الخلايا العصبية أو البودوسييت، ويمكن أن يحفز التعبير عن الإجهاد وجينات الاستجابة للصدمات الحرارية7،12. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام المنظفات أثناء فصل الغشاء النووي وتمزق يؤدي إلى تجميع23،25. وهكذا، فإن تحسين الانفصام للحصول على خلية واحدة أو تعليق نوات من أعلى مستويات الجودة هو أمر بالغ الأهمية لنجاح تجارب التنميط عالية الإنتاجية.
هنا، نُظهر طريقة عزل المنظفات والنياتية الخالية من الإنزيمات التي تسمح باستخراج النوى السليمة من دماغ الحمار الوحشي في أقل من 20 دقيقة. البروتوكول يعطي نوى مع مورفولوجيا نموذجية وسلامة قوية (الشكل 2). من دماغ حمار وحشي واحد يزن 6 ملغ، ينتج البروتوكول ما مجموعه 60,000 نواة يحددها عدد مقياس الدم. ويمكن استخدام النوى المعزولة لتطبيقات متعددة من المصب، بما في ذلك snRNA-seq، ATAC-seq، والمناعة. وقد تشمل النوى المعزولة التلوث المتبادل من الكسور السيتوبلازمية، ولا سيما من مكونات التشنج الوبوبلازمي والميتوكوندريا. وبالنسبة لتجارب التنميط العالية، يوصى بشدة بإزالة الحطام الخلوي، ولا سيما الميتوكوندريا. تدفق cytometry (الشكل 3) يوفر خيارا قابلا للتطبيق لتنقية النوى. وبدلا من ذلك، يمكن أيضا استخدام تدرج السكروز لإزالة الحطام.
وقد تم اختبار البروتوكول على الغدة الدرقية الماوس (البيانات غير مبينة) ويقدم نتائج مماثلة لالأنسجة الدماغي حمار وحشي. وبشكل عام، يوفر البروتوكول طريقة قوية وقابلة للاستنساخ والعالمية لإعداد التعليق نواة واحدة، مما يساعد على تبسيط الخدمات اللوجستية لتجارب التنميط عالية الإنتاجية.
The authors have nothing to disclose.
نشكر أعضاء مختبر الدكتور سابين كوستاغليولا وسينغ على تعليقاتهم على المخطوطة. وقد دعم هذا العمل من قبل Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS تحت رقم المنحة 34772792 – MISU إلى S.P.S.
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |