Bu çalışma, yeşil floresan protein ve biyolüminesans sinyallerinin yanı sıra kantitatif moleküler algılama tekniğinin entegrasyonu ile tümör yüklemesini doğru bir şekilde değerlendirmek için gelişmiş bir protokol hazırlaştır.
Üçlü negatif meme kanseri (TNBC) sınırlı tedavi seçenekleri ile agresif bir meme kanseri alt türüdür. Daha az agresif meme tümörü olan hastalarla karşılaştırıldığında, TNBC hastalarının 5 yıllık sağkalım oranı karakteristik ilaca dirençli fenotip ve metastatik yükü nedeniyle %77’dir. Bu doğrultuda, TNBC tümör büyümesini ve metastatik yayılımı sınırlayan yeni tedavi stratejilerini belirlemeyi amaçlayan minin modelleri oluşturulmuştur. Bu çalışma, bir bodrum zarı matris asılı MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri yakından insanlarda kanser hücresi davranışını taklit dördüncü meme yağ yastığı implante edildiği TNBC ortotopik modeli için pratik bir kılavuz açıklar. Tümörlerin kaliper ile ölçümü, in vivo ve ex vivo görüntüleme ile akciğer metastazı değerlendirmesi ve moleküler saptama tartışılmıştır. Bu model terapötik etkinliğini incelemek için mükemmel bir platform sağlar ve özellikle primer tümör ve distal metastatik siteler arasındaki etkileşimin incelenmesi için uygundur.
Amerika Birleşik Devletleri’nde yaklaşık bir sekiz kadın ömrü boyunca invaziv meme kanseri gelişecektir, ve 10% −20% agresif üçlü negatif meme kanseri tanısı olacak (TNBC) alt tipi. Primer lezyonlar çoğu durumda cerrahi olarak çıkarılabilirken, subklinik mikrometastaz ve kemodirenç onu inatçı bir hastalık haline getirse de. Daha da önemlisi, metastatik TNBC olan hastaların çoğu sonunda nüks, onlar erken aşamada tedavi uygulandı bile1. Bu nedenle, kanser heterojenitesi, mikrometastaz ve terapötik direnç TNBC hastalarının başarılı klinik sonuçlarını sınırlayan üç önemli sorundur. Bu nedenle, Daha iyi TNBC polimorfik moleküler arka plan anlamak ve metastatik hastalığı sınırlayan etkili terapötik ajanlar geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır.
Tümör metastazı, tümör hücresinin mikroçevresini kontrol ettiği ve mikroçevresini kontrol ettiği ve mikroçevresini gasp ettiği, membran bozulması ve tümör hücresinin primer lezyondan kaçışı yoluyla, vazodan giriş (yani, ekstravazasyon) yoluyla ve sonuçta adaptasyon ve kolonizasyon yoluyla kendi mikroçevresini gasp ettiği çok aşamalı bir süreçtir2. Hayvan modelleri meme kanseri metastazı çalışmak için geliştirilmiştir, burada iki metodoloji yaygın olarak uygulanmaktadır: direkt kan dolaşımı enjeksiyonu ve ortotopik implantasyon. Doğrudan kan dolaşımı enjeksiyonu için yaygın olarak kullanılan yöntemler kuyruk damar enjeksiyonu dahil, doğrudan kardiyak enjeksiyon dahil olmak üzere diğer yaklaşımlar3, direkt beyin enjeksiyonu4, ve doğrudan karaciğer enjeksiyonu5 de istihdam edilmiştir. Doğrudan kan dolaşımı enjeksiyonu genellikle bir yapay metastaz modeli olarak adlandırılır, hangi hızlı ve kolay ama daha az fizyolojik olarak doğru çünkü primer lezyon ve intravazasyon tümör kaçış atlatır6,7,8. Doğrudan enjeksiyon modelleri ile karşılaştırıldığında, ortotopik meme kanseri modeli akciğer gibi uzak organlarda saptanabilir metastatik lezyonların oluşumu için daha uzun sürer, ancak yakından insanlarda meydana geldiği gibi çok adımlı metastatik süreci taklit çünkü fizyolojik olarak daha alakalıdır. Daha da önemlisi, 2013 yılında yapılan bir çalışmadakuyruk damar enjeksiyonu ve ortotopik modeller karşılaştırılmış ve kuyruk damarına enjekte edilen meme kanseri hücrelerinin ve kuyruk damar enjeksiyonundan sonra akciğer metastatik lezyonlarından izole edilenlerin benzer küresel gen ekspresyonu profilleri sergilendiği bulunmuştur. Buna karşılık, ortokjenik enjekte meme kanseri hücrelerinin küresel gen ekspresyonu profili ortotonik enjekte hücrelerden kaynaklanan akciğer metastatik lezyonların önemli ölçüde farklıydı9. Bu gözlemler ortotopik modelin fizyolojik olarak daha alakalı olduğunu göstermektedir, çünkü metastatik lezyonlar insanlarda meydana geldiği gibi çok aşamalı metastaz sürecine benzer bir seçim sürecinden geçmektedir.
Bu çalışmada, laboratuarımızda görüntüleme algılama teknikleri için optimize edilmiş çıplak farelerde ortotopik meme kanseri (MDA-MB-231-Luc/GFP) modelinin yanı sıra yeni biyobelirteçlerin belirlenmesi ve hedefe yönelik kemoterapötik ajanların geliştirilmesi anlatılmaktadır.
Hayvanlarda TNBC çalışması için, iki murine modelleri geliştirilmiştir: Bağışıklık tehlikeye farelerde MDA-MB-231 insan meme adenokarsinom hücreleri (yani atimik çıplak fareler, NSG fareler), ve 4T1 bağışıklık-yetkili BALB / c fareler. Her iki modelin de avantajları vardır. Bir çalışma için hayvan modelinin seçimi araştırma hedeflerine bağlıdır. Örneğin, MDA-MB-231 modeli immünosupresif insan meme kanseri hastaları taklit bağışıklık laşmış farelerde yetiştirilen bir insan TNBC hücre hattıdır. Öte yandan, BALB/c farelerinde ortotopik 4T1 üçlü negatif murin meme kanseri hücrelerinin invaziv fenotipleri, evre IV insan meme kanseri hastalarında meydana geldiği için metastatik süreci yakından taklit eder. Intravenöz hücre enjeksiyonu yaklaşımı aksine, insan MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri benzer meme yağ pedi enjekte edildi11,12 ortotopik meme kanseri modeli11,13. Uzun tümör büyümesi ve edinsel metastatik yeteneği daha fizyolojik olarak ilgili, bu nedenle yapay bir metastatik kanser modeli değildir4,14. Böyle bir spontan metastaz modeli yakından inisiyasyon aşaması dışında insan meme kanseri gelişimini taklit eder. Bu metastatik meme kanserinde in vivo ilaç taraması ve terapötik etkinlik değerlendirmesi için önemli bir modeldir.
Faredeki tümör implantasyon bölgesi, tümör büyümesini ve insanlarda meydana gelene benzer metastatik fenotip seçimisağlayan bir mikroortamın sağlanmasında önemli bir rol oynar. Proksimal lenf düğümü ve yağ dokusunun varlığı meme kanserinin hastalık ilerlemesini etkileyen önemli faktörlerdir15,16. Bir insan hastada, lenf düğümü ve yağ dokusu hem malignite ve meme kanseri insidansını etkileyen önemli etkileşen faktörlerdir17,18,19. Böylece, enjeksiyon bölgesi için doğru anatomik yerseçimi insan hastalığına göre tümör modelinin alaka kuvvetini oldukça etkileyebilir. Bu çalışmada, dördüncü meme bezi implantasyon bölgesi olarak esas olarak yukarıda belirtilen gereksinimleri nedeniyle kullanılan ve anatomik olarak daha erişilebilir ve manipüle etmek daha kolay olduğunu.
Farklı tümör hacmi hesaplama yöntemleri mevcuttur, ve bir araştırmacı uygun gördükleri herhangi seçebilirsiniz. Bu çalışma için seçilen algoritma, farklı tümör hacmi hesaplama formüllerini karşılaştıran ve aşağıdaki formülün en doğru20olduğu sonucuna varan Faustino-Rocha ve ark.’nın bulgularına dayanmaktadır.
Bazal membran matriks çeşitli in vitro21 ve in vivo22,,23 tahlillerde kullanılan önemli bir hücre dışı matristir. 2222,24,25 ksenogreft malignitesi üzerinde bazal membran matris etkisi ile ilgili çelişkili raporlar vardır. Sadece ksenogreft in ilk kurulmasını etkiler ve ksenogreft büyüme üzerinde daha fazla etkisi var gibi görünüyor25. Açıklanan ksenogreft implantasyonu için, bazal membran matrisi implantasyon dan önce hücre/jel karışımı çözeltisi viskozitesini artırmak için kanser hücreleri ile karıştırıldı. İnatmembran matrisinin varlığı enjeksiyon bölgesinden karışım çözeltisi kaybını azaltır ve miksçözeltiyi implantasyon yerinde tutar, böylece implante edilen ksenogreft hacminin tekdüzeliğini artırır.
MDA-MB-231 hücre hattı kötü huylu ölümsüzleştirilmiş insan meme adenokarsinom hücre hattı ve üçlü negatif durumu nedeniyle meme kanseri araştırmalarında popüler bir araçtır. Çift muhabir (luciferase ve GFP) hücre hattı kullanımı in vivo ve ex vivo görüntüleme işleme daha fazla esneklik sağlar. Biyolüminesans sinyalinin GFP sinyallerinden daha fazla hassasiyet, derinlik algılanabilirliği ve üstün kontrasta (sinyal-gürültü oranı) sahip olduğu iyi bilinmektedir. Bu nedenle, tüm vücut görüntüleme için yaygın olarak kullanılan bir görüntüleme yöntemidir. Ne yazık ki, biyolüminesans algılama sinyal algılama doğrusal olduğu dar bir zaman penceresi (~ 15−20 dakika sonrası luciferin enjeksiyonu) ile sınırlıdır. BLI sinyali hayvanlar ötenazi yapıldığında hızla azalır. Birçok fare ötanazi ve birden fazla doku veya organ hasat gerekiyorsa bu deneysel bir tasarım sorunu haline gelir. Bu çalışmalarda doğrudan kalp delinmesi ile kan alındı, beyin, primer tümör, akciğer ve etkilenen lenf nodu 40 farede incelendi. Organlar hasat edilip ek vivo görüntülemeye hazır hale gelene kadar biyolüminesans sinyali tespit edilemiyordu. Bu nedenle, GFP algılama bu durumlarda daha uygundur. GFP sinyalinin salınımı görünür aralıktadır ve bu dalga boylarında kana bağlı sinyal emilimi (yani hemoglobin) önemli ölçüde daha yüksektir. Ayrıca, NADH, lipo-pigmentler ve flavins nedeniyle görünür aralıkta otofloresans, düşük seviyeli GFP sinyali ile otofloresan arka planı ayırt etmeyi zorlaştıran önemli bir arka planla sonuçlanır. Geleneksel filtre çifti görüntüleme yerine multispektral floresan görüntüleme yaklaşımı kullanmak ve spektral karıştırma algoritmaları kullanmak, ilgi alanında gerçek GFP sinyalini belirlemeye yardımcı olur. Bu nedenle, vivo algılama ve ex vivo organ / doku değerlendirmelerinde multispektral GFP görüntüleme tüm vücutta biyolüminesans görüntüleme güçlü birleştirerek, ölçülebilir veri farelerin büyük bir kohort en üst düzeye çıkarılabilir.
Bir hayvan çalışması için hangi yaklaşım seçilirse seçilsin, özellikle metastatik yükü hedefleyen çalışmalarda, organ/doku alımı öncesinde tüm kanın çıkarılması şiddetle tavsiye edilir. Bu protokol, ortotopik meme kanseri modelinde bulunan farelerden alınan tüm kan örneklerinden alınan GFP sinyallerini gerçek zamanlı PCR tahlilleri ile algılar. Organlarda/dokularda kan hacminin en aza indirilmesi hedef organlardaki yanlış pozitif sinyali azaltacaktır.
Sonuç olarak, MDA-MB-231-Luc/GFP hücrelerini kullanan ortotopik meme kanseri modeli, insan TNBC hasta durumunu yakından taklit eden son derece alakalı bir hayvan modelidir. Bu model, insana benzer bir tümör mikroortamında terapötik etkinliğin incelenmesi, izlenmesi ve değerlendirilmesi için gereklidir. Çift muhabir hücre hatlarının kullanımı daha bu ortotopik meme kanseri modelinin pratikliğini artırır.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda MD, Kanser ve İnflamasyon Programı intramural Araştırma Programı ve Frederick Ulusal Laboratuvarı – Küçük Hayvan Görüntüleme Programı tarafından destek kabul etmek istiyorum, Leidos Biyomedikal Araştırma, Inc, Frederick Maryland, ABD.
Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
Primer3 | MIT | Primer Design | |
Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |