Ce travail préséque un protocole avancé pour évaluer avec précision la charge tumorale par la détection de protéines fluorescentes vertes et de signaux de bioluminescence ainsi que l’intégration de la technique quantitative de détection moléculaire.
Le cancer du sein triple négatif (TNBC) est un sous-type agressif de cancer du sein avec des options thérapeutiques limitées. Par rapport aux patients présentant des tumeurs mammaires moins agressives, le taux de survie de 5 ans des patients de TNBC est de 77% en raison de leur phénotype pharmacorésistant caractéristique et de leur fardeau métastatique. Vers cette fin, des modèles murins ont été établis visant à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques limitant la croissance tumorale de TNBC et la propagation métastatique. Ce travail décrit un guide pratique pour le modèle orthotopique de TNBC où les cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231 suspendues dans une matrice de membrane de sous-sol sont implantées dans le quatrième coussin de graisse mammaire, qui imite étroitement le comportement de cellules cancéreuses chez l’homme. Mesure des tumeurs par caliper, évaluation de métastase de poumon par l’intermédiaire de la formation image in vivo et ex vivo, et la détection moléculaire sont discutées. Ce modèle fournit une excellente plate-forme pour étudier l’efficacité thérapeutique et est particulièrement approprié pour l’étude de l’interaction entre la tumeur primaire et les sites métastatiques distal.
Environ une femme sur huit aux États-Unis développera un cancer du sein invasif au cours de sa vie, et 10 % à 20 % de ces femmes recevront un diagnostic de sous-type agressif triple négatif du cancer du sein (TNBC). Tandis que les lésions primaires peuvent être chirurgicalement enlevées dans la plupart des cas, la microméstase subclinique et la chimmoresistance en font une maladie insoluble. Fait important, la plupart des patients atteints de TNBC métastatique finissent par rechute, même s’ils ont subi un traitement au stadeprécoce 1. Ainsi, l’hétérogénéité de cancer, la microméstase, et la résistance thérapeutique sont trois défis principaux limitant les résultats cliniques réussis des patients de TNBC. Par conséquent, il est urgent de mieux comprendre le fond moléculaire polymorphe de TNBC et de développer des agents thérapeutiques efficaces qui limitent les maladies métastatiques.
La métastase tumorale est un processus multistep où la cellule tumorale contrôle et usurpe son microenvironnement pour favoriser sa propre dissémination par la dégradation de la membrane et l’évasion de cellules tumorales de la lésion primaire, par l’entrée dans (c.-à-d. l’intravasation) et la sortie de (c.-à-d., l’extravasation) la vascularisation, et finalement l’adaptation et la colonisation dans les lits tissulaires distal2. Des modèles animaux ont été développés pour étudier la métastase du cancer du sein, où deux méthodologies sont généralement mises en œuvre : l’injection directe de circulation sanguine et l’implantation orthotopique. Les méthodes couramment utilisées pour l’injection directe de circulation sanguine incluent l’injection de veine de queue, tandis que d’autres approches comprenant l’injection cardiaque directe3,l’injection directe de cerveau4,et l’injection directe de foie5 ont également été employées. L’injection directe de circulation sanguine est souvent appelée un modèle artificiel de métastase, qui est rapide et facile mais moins physiologiquement précis parce qu’il contourne l’évasion de tumeur de la lésion primaire et l’intravasation6,7,8. Par rapport aux modèles d’injection directe, le modèle orthotopique de cancer du sein prend plus de temps pour l’occurrence des lésions métastatiques détectables dans les organes éloignés tels que le poumon, mais il est plus physiologiquement pertinent parce qu’il imite étroitement le processus métastatique multistep pendant qu’il se produit chez l’homme. Fait important, une étude 20139 a comparé l’injection de veine de queue et les modèles orthotopiques et a constaté que les cellules cancéreuses du sein injectées dans la veine arrière et celles isolées des lésions métastatiques de poumon après injection de veine de queue ont montré des profils globaux semblables d’expression de gène. En revanche, le profil d’expression génétique mondial des cellules cancéreuses du sein orthotopiquement injectées était radicalement différent de celui des lésions métastatiques pulmonaires provenant des cellules orthotopiquement injectées9. Ces observations suggèrent que le modèle orthotopique soit plus physiologiquement pertinent, parce que les lésions métastatiques subissent un processus de sélection semblable au processus multistep de métastase pendant qu’elle se produit chez l’homme.
Ce travail décrit un modèle orthotopique de cancer du sein (MDA-MB-231-Luc/GFP) chez les souris nues qui a été optimisé dans notre laboratoire pour des techniques de détection d’imagerie ainsi que l’identification de nouveaux biomarqueurs et le développement d’agents chimiothérapeutiques ciblés.
Pour l’étude de TNBC chez les animaux, deux modèles murins ont été développés : les cellules humaines MDA-MB-231 d’adénocarcinome humain chez les souris immunodéprimées (c.-à-d. souris nues athymiques, souris NSG), et la 4T1 chez les souris BALB/c immunodéprimées. Les deux modèles ont leurs avantages. Le choix du modèle animal pour une étude dépend des objectifs de recherche. Par exemple, le modèle MDA-MB-231 est une lignée cellulaire humaine TNBC cultivée chez des souris immunodéprimées qui imite les patientes immunodéprimées du cancer du sein humain. D’autre part, le phénotype invasif des cellules cancéreuses du sein murine triple-négatives orthotopiques 4T1 chez les souris BALB/c imite étroitement le processus métastatique comme il se produit dans les patients atteints de cancer du sein humain de stade IV. Contrairement à l’approche d’injection de cellules intraveineuses, les cellules humaines de cancer du sein MDA-MB-231 ont été également injectées dans le coussin de graisse mammaire11,12 dans le modèle orthotopique de cancer du sein11,13. La croissance de tumeur plus longue et la capacité métastatique acquise est plus physiologiquement pertinente, ainsi ce n’est pas un modèle artificiel de cancer métastatique4,14. Un tel modèle spontané de métastase imite étroitement le développement humain de cancer du sein excepté l’étape d’initiation. Il s’agit d’un modèle crucial pour le dépistage des médicaments in vivo et l’évaluation de l’efficacité thérapeutique dans le cancer du sein métastatique.
Le site d’implantation de tumeur dans la souris joue un rôle crucial en fournissant un microenvironnement qui soutient la croissance de tumeur et la sélection du phénotype métastatique semblable à celui qui se produit dans l’homme. Le ganglion lymphatique proximale et la présence de tissu adipeux sont les facteurs clés affectant la progression de la maladie du cancer du sein15,16. Dans un patient humain, le ganglion lymphatique et le tissu adipeux sont tous deux des facteurs d’interaction clés affectant la malignité et l’incidence du cancer du sein17,18,19. Ainsi, la sélection de l’emplacement anatomique correct pour le site d’injection peut fortement impacter la pertinence du modèle de tumeur comparé à la maladie humaine. Cette étude a utilisé la quatrième glande mammaire comme site d’implantation principalement en raison des exigences susmentionnées et qu’il est anatomiquement plus accessible et plus facile à manipuler.
Différentes méthodes de calcul du volume tumoral sont disponibles, et un chercheur peut choisir tout ce qu’ils jugent bon. L’algorithme sélectionné pour cette étude est basé sur les résultats de Faustino-Rocha et al., qui a comparé différentes formules de calcul du volume tumoral et a conclu que la formule ci-dessous est la plus précise20.
La matrice de membrane de sous-sol est une matrice extracellulaire importante utilisée dans divers in vitro21 et in vivo22,23 essais. Il y a des rapports contradictoires22,24,25 concernant l’influence de la matrice de membrane de sous-sol sur la malignité de xénogreffe. Il semble affecter uniquement l’établissement initial de la xénogreffe et n’ont aucun effet supplémentaire sur la croissance de xénogreffe25. Pour l’implantation de xénogreffe décrite, la matrice de membrane de sous-sol a été mélangée avec les cellules cancéreuses pour augmenter la viscosité de solution de mélange de cellules/gel avant l’implantation. La présence de la matrice de membrane de sous-sol réduit la perte de solution de mélange du site d’injection et maintient la solution de mélange au site d’implantation, augmentant ainsi l’uniformité du volume implanté de xénogreffe.
La lignée cellulaire MDA-MB-231 est une lignée maligne de cellules humaines de sein immortalisée et est un outil populaire dans la recherche sur le cancer du sein en raison de son statut triple négatif. L’utilisation de la ligne cellulaire des doubles reporters (luciferase et GFP) permet une plus grande flexibilité dans la manipulation de l’imagerie in vivo et ex vivo. Il est bien établi que le signal de bioluminescence possède une plus grande sensibilité, une plus grande détectabilité de la profondeur et un contraste supérieur (rapport signal-bruit) que les signaux GFP. Pour cette raison, il s’agit d’une modalité d’imagerie largement utilisée pour l’imagerie du corps entier. Malheureusement, la détection de bioluminescence est limitée par une fenêtre de temps étroite (injection post-luciferine de 15 à 20 minutes) au cours de laquelle la détection du signal est linéaire. Le signal BLI diminue rapidement lorsque les animaux sont euthanasiés. Cela devient un problème de conception expérimentale si de nombreuses souris ont besoin d’être euthanasiées et la récolte de tissus ou d’organes multiples est nécessaire. Dans ces études, le sang a été récolté par la ponction directe de coeur, le cerveau, la tumeur primaire, le poumon, et le ganglion lymphatique affecté ont été examinés dans 40 souris. Au moment où les organes ont été récoltés et prêts pour la formation image ex vivo, le signal de bioluminescence était indétectable. Par conséquent, la détection GFP est plus appropriée dans ces situations. L’émission du signal GFP se situe dans la plage visible, et à ces longueurs d’onde, l’absorption du signal due au sang (c.-à-d. l’hémoglobine) est significativement plus élevée. En outre, l’autofluorescence dans la gamme visible due à NADH, lipo-pigments, et flavins donne dans un fond significatif qui le rend difficile de distinguer entre un signal GFP de bas niveau et le fond d’autofluorescence. L’utilisation d’une approche d’imagerie par fluorescence multispectrale au lieu de l’imagerie traditionnelle de la paire de filtres et l’utilisation d’algorithmes spectrals de mélange aident à identifier le signal GFP vrai dans l’organe d’intérêt. Par conséquent, en combinant les forces de l’imagerie de bioluminescence dans la détection in vivo du corps entier et l’imagerie multispectrale de GFP dans les évaluations d’organes/tissus ex vivo, les données quantifiables peuvent être maximisées dans une grande cohorte de souris.
Quelle que soit l’approche choisie pour une étude animale, l’extraction de tout le sang avant la récupération des organes et des tissus est fortement recommandée, en particulier pour les études ciblant le fardeau métastatique. Ce protocole détecte les signaux GFP provenant des échantillons de sang entiers prélevés sur les souris (données non montrées) dans le modèle orthotopique de cancer du sein par des essais EN temps réel de PCR. Minimiser le volume sanguin dans les organes/tissus réduira le signal faux positif dans les organes cibles.
En conclusion, le modèle orthotopique de cancer du sein utilisant les cellules MDA-MB-231-Luc/GFP est un modèle animal très pertinent qui imite étroitement l’état humain de patient de TNBC. Ce modèle est essentiel pour étudier, surveiller et évaluer l’efficacité thérapeutique dans un microenvironnement tumoral semblable aux êtres humains. L’utilisation de lignées cellulaires à double reporter améliore encore l’aspect pratique de ce modèle orthotopique de cancer du sein.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs aimeraient souligner le soutien du Programme de recherche intra-muros des National Institutes of Health, de l’Institut national du cancer, de Bethesda MD, du Cancer and Inflammation Program et du Frederick National Laboratory – Small Animal Imaging Program, Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Maryland, États-Unis.
Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
Primer3 | MIT | Primer Design | |
Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |