这项工作预设了一种高级协议,通过检测绿色荧光蛋白和生物发光信号以及定量分子检测技术的集成来准确评估肿瘤负荷。
三阴性乳腺癌 (TNBC) 是一种具有攻击性的乳腺癌亚型,治疗选择有限。与恶性肿瘤较不强的患者相比,TNBC患者5年生存率为77%,其特有的耐药表型和转移负担。为此,建立了鼠型模型,旨在确定限制TNBC肿瘤生长和转移传播的新治疗策略。本研究描述了TNBC正位模型的实用指南,其中MDA-MB-231乳腺癌细胞悬浮在地下室膜基质中,植入第四个乳腺脂肪垫,密切模仿人体癌细胞的行为。讨论了通过卡钳测量肿瘤、通过体内和活体成像进行肺转移评估以及分子检测。该模型为研究疗效提供了一个极好的平台,特别适用于原发性肿瘤与远端转移位点相互作用的研究。
在美国,大约八分之一的妇女将在她有生之年患上侵入性乳腺癌,其中10%-20%的妇女将被诊断为侵略性三重阴性乳腺癌(TNBC)亚型。虽然主要病变可以在大多数情况下被手术切除,但亚临床微转移和化学抵抗使其成为一种难以治愈的疾病。重要的是,大多数转移性TNBC患者最终复发,即使他们在早期阶段1接受治疗。因此,癌症异质性、微转移性和治疗性是制约TNBC患者成功临床结果的三大挑战。因此,迫切需要更好地了解TNBC的多态分子背景,并开发限制转移性疾病的有效治疗剂。
肿瘤转移是一个多步骤的过程,肿瘤细胞控制并篡夺其微环境,通过膜降解和肿瘤细胞从原发病变中逃脱,通过进入(即血管内)和退出(即外显)血管,最终适应和殖民化在远端组织床2促进自身传播。动物模型已经开发用于研究乳腺癌转移,其中通常实施两种方法:直接血液循环注射和正交植入。常用的血液循环注射方法包括尾静脉注射,其他方法包括直接心脏注射3,直接脑注射4,直接肝注射5也已被使用。直接血液循环注射通常被称为人工转移模型,这是快速和容易,但生理上不太准确,因为它绕过肿瘤从原发病变和血管内6,7,87,8逃脱。与直接注射模型相比,正交乳腺癌模型在肺癌等远程器官中可检测到的转移病变的发生需要更长的时间,但它在生理上更相关,因为它密切模仿了发生在人类中的多步转移过程。重要的是,2013年的一项研究9比较了尾静脉注射和正交模型,发现注入尾静脉的乳腺癌细胞和从尾部静脉注射后从肺转移病变中分离出来的乳腺癌细胞表现出类似的全球基因表达特征。相比之下,正位注射乳腺癌细胞的全球基因表达特征与正交注射细胞9引起的肺转移病变的基因组表达特征明显不同。这些观察表明,正位模型在生理上更相关,因为转移性病变经历的选择过程类似于转移的多步过程,因为它发生在人类身上。
本研究描述了裸鼠的正位乳腺癌(MDA-MB-231-Luc/GFP)模型,该模型在我们的实验室中进行了优化,用于成像检测技术以及新型生物标志物的鉴定和靶向化疗剂的开发。
在动物中研究TNBC时,已经开发了两种母鼠模型:免疫受损小鼠(即心酸裸鼠、NSG小鼠)的MDA-MB-231人类乳腺腺癌细胞,以及免疫能力BALB/c小鼠中的4T1。两种型号都有其优点。研究动物模型的选择取决于研究目标。例如,MDA-MB-231模型是生长在免疫功能低下小鼠中的人类TNBC细胞系,模仿免疫抑制的人类乳腺癌患者。另一方面,BALB/c小鼠中正畸4T1三阴性鼠乳癌细胞的侵入性表型密切模仿转移过程,因为它发生在第四阶段人类乳腺癌患者。与静脉注射细胞的方法不同,人类MDA-MB-231乳腺癌细胞同样被注射到乳腺脂肪垫11,12,12在正交乳腺癌模型11,13。,13肿瘤生长时间越长,转移能力在生理上更相关,因此它不是人工转移癌模型4,4、14。这种自发转移模型密切模仿人类乳腺癌的发展,除了启动阶段。这是转移性乳腺癌体内药物筛查和疗效评估的重要模型。
小鼠中的肿瘤植入位在提供维持肿瘤生长的微环境以及选择类似于人类的转移性表型方面起着至关重要的作用。近端淋巴结和脂肪组织的存在是影响乳腺癌疾病进展的关键因素15,16。15,在人类患者中,淋巴结和脂肪组织都是影响恶性肿瘤,18,和乳腺癌发病率的关键相互作用因素。因此,选择注射部位的正确解剖位置,可以对人类疾病影响肿瘤模型的相关性。这项研究使用第四个乳腺作为植入部位,主要是因为上述要求,它是在解剖学上更容易和更容易操作。
不同的肿瘤体积计算方法,研究人员可以选择任何他们认为合适的。本研究选择的算法是基于福斯蒂诺-罗查等人的发现,他比较了不同的肿瘤体积计算公式,并得出结论,下面的公式是最准确的20。
基底膜基质是一种重要的细胞外基质,用于各种体外21和体内22、23,23检测。关于地下膜基质对异种移植恶性肿瘤的影响的报告22、24、25日有矛盾。22,24,25它似乎只影响异种移植的初始建立,对异种移植生长25没有进一步的影响。对于所述的异种移植植入,基底膜基质与癌细胞混合,以增加植入前的细胞/凝胶混合溶液粘度。基底膜基质的存在减少了注射部位的混合溶液损失,并将混合溶液保持在植入部位,从而提高了植入异种移植量的均匀性。
MDA-MB-231细胞系是一种恶性不朽的人类乳腺腺癌细胞系,因其三阴性状态,是乳腺癌研究中流行的工具。使用双分子(透明酶和GFP)细胞系,可以更灵活地处理体内和前活体成像。众所周知,生物发光信号比GFP信号具有更高的灵敏度、深度可探测性和卓越的对比度(信噪比)。因此,它是一种广泛使用的全身成像成像方式。遗憾的是,生物发光检测受到信号检测线性的狭窄时间窗口(荧光素注射后±15~20 分钟)的限制。当动物被安乐死时,BLI信号会迅速减弱。如果许多小鼠需要安乐死,需要收集多个组织或器官,这就成为一个实验设计问题。在这些研究中,血液是通过直接心脏穿刺采集的,大脑、原发性肿瘤、肺和受影响的淋巴结在40只小鼠身上被检查。当器官被采集并准备进行前活体成像时,生物发光信号已检测不到。因此,GFP检测更适合在这些情况下。GFP 信号的发射在可见范围内,在这些波长下,由于血液(即血红蛋白)引起的信号吸收明显较高。此外,由于 NADH、脂颜料和黄酮,可见范围内的自动荧光导致显著背景,因此很难区分低电平 GFP 信号和自荧光背景。采用多光谱荧光成像方法,而不是传统的滤波器对成像,并使用光谱解混合算法有助于识别感兴趣器官中的真实 GFP 信号。因此,通过结合生物发光成像在体内检测和多光谱GFP成像在活体器官/组织评估中的优势,可量化的数据可以在大量小鼠中最大化。
无论为动物研究选择哪种方法,强烈建议在器官/组织检索之前提取所有血液,尤其是针对转移负担的研究。该协议通过实时PCR检测,检测从正交乳腺癌模型中小鼠(未显示的数据)中从小鼠获得的整个血液样本的GFP信号。尽量减少器官/组织的血液量将减少目标器官中的误报信号。
最后,使用MDA-MB-231-Luc/GFP细胞的正位乳腺癌模型是一种高度相关的动物模型,它密切模仿人类TNBC患者的状况。该模型对于研究、监测和评估类似人类的肿瘤微环境的治疗效果至关重要。双报告细胞系的使用进一步提高了这种正交乳腺癌模式的实用性。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢国家卫生研究院、国家癌症研究所、贝塞斯达医学博士、癌症和炎症计划以及弗雷德里克国家实验室-小动物成像计划的支持,莱多斯生物医学研究公司,弗雷德里克马里兰,美国。
Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
Primer3 | MIT | Primer Design | |
Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |