本研究は、緑色蛍光タンパク質および生物発光シグナルの検出と定量的分子検出技術の統合によって腫瘍負荷を正確に評価するための高度なプロトコルをプリセットする。
トリプルネガティブ乳癌(TNBC)は、限られた治療選択肢を有する積極的な乳癌サブタイプである。あまり積極的な乳房腫瘍を有する患者と比較すると、TNBC患者の5年生存率は、その特徴的な薬剤耐性表現型および転移性負担のために77%である。この目的に向けて、マウスモデルは、TNBC腫瘍の増殖および転移性広がりを制限する新しい治療戦略を同定することを目的として確立されている。この研究は、ヒトの癌細胞挙動を密接に模倣する第4乳腺脂肪パッドに、基底膜マトリックスに懸濁したMDA-MB-231乳癌細胞を移植するTNBC同位体モデルの実用的なガイドを説明する。キャリパーによる腫瘍の測定、生体内およびエキソビボイメージングによる肺転移評価、および分子検出について検討する。このモデルは、治療効果を研究するための優れたプラットフォームを提供し、原発性腫瘍と遠位転移部位との相互作用の研究に特に適している。
米国では約8人に1人の女性が生涯に浸潤性乳癌を発症し、これらの女性の10%~20%が積極的なトリプルネガティブ乳癌(TNBC)サブタイプと診断される。原発性病変はほとんどの場合外科的に除去することができるが、亜臨床微小転移および化学抵抗性はそれを難治性疾患にする。重要なことに、転移性TNBCを有するほとんどの患者は、たとえ初期段階1で治療を受けたとしても、最終的に再発する。したがって、がんの不均一性、微小転移、および治療抵抗性は、TNBC患者の臨床結果の成功を制限する3つの大きな課題である。したがって、TNBCの多形分子背景をよりよく理解し、転移性疾患を制限する効果的な治療薬を開発することが急務である。
腫瘍転移は、腫瘍細胞が原発病変(すなわち、血管内切断)への侵入および血管内(すなわち、血管内切断)からの出口を介して、膜分解および腫瘍細胞脱出を介してそれ自身の普及を促進するために、その微小環境を制御し、誘惑する多段階のプロセスであり、最終的には血管内の適応および植民地化である2。動物モデルは、直接血液循環注射と直腸移植の2つの方法論が一般的に実施される乳癌転移を研究するために開発されました。直接血液循環注射のための一般的に採用された方法は、尾静脈注射を含むが、直接心臓注射3、直接脳注射4、および直接肝注射5を含む他のアプローチも採用されている。直接血液循環注射は人工転移モデルと呼ばれることが多く、これは、原発性病変および内空部からの腫瘍脱出を回避するため、迅速かつ容易であるが生理学的に正確ではない66、7、87,8である。直噴モデルと比較すると、直交性乳癌モデルは、肺などの遠隔器官における検出可能な転移性病変の発生に時間がかかるが、ヒトで起こる多段階転移過程を密接に模倣するため、より生理学的に関連する。重要なことに、2013年の研究9は、尾静脈注射と直腸モデルを比較し、尾静脈に注入された乳癌細胞と尾静脈注射後の肺転移病変から分離されたものが同様のグローバル遺伝子発現プロファイルを示したことを発見した。対照的に、同一性注入乳癌細胞の全域遺伝子発現プロファイルは、同交性注入細胞9に起因する肺転移性病変のそれとは劇的に異なっていた。これらの観察は、転移性病変がヒトで起こるように転移の多段階プロセスと同様の選択プロセスを経るので、正交性モデルがより生理学的に関連していることを示唆している。
この研究は、イメージング検出技術のために当研究室で最適化されたヌードマウスの好交性乳癌(MDA-MB-231-Luc/GFP)モデル、ならびに新しいバイオマーカーの同定および標的化学療法剤の開発について説明する。
動物におけるTNBCの研究では、免疫不全マウス(扁平上皮性ヌードマウス、NSGマウス)におけるMDA-MB-231ヒト乳房腺癌細胞と、免疫に優れたBALB/cマウスの4T1の2つのマウスモデルが開発されている。どちらのモデルにも利点があります。研究のための動物モデルの選択は、研究目標に依存します。例えば、MDA-MB-231モデルは、免疫抑制されたヒト乳癌患者を模倣する免疫不全マウスで増殖したヒトTNBC細胞株である。一方、BALB/cマウスにおける異所4T1トリプルネガティブマウス乳癌細胞の侵襲的表現型は、ステージIVヒト乳癌患者に生じる転移過程を密接に模倣する。静脈内細胞注射アプローチとは異なり、ヒトMDA-MB-231乳癌細胞は、同様に、異性体性乳癌モデル11、13において乳腺脂肪パッド11、12,13に注入された。11,12より長い腫瘍増殖および獲得した転移能がより生理的に関連し、したがって、人工転移癌モデル44、1414ではない。このような自発的転移モデルは、開始段階を除いてヒト乳癌の発症を密接に模倣する。これは、転移性乳癌におけるインビボ薬物スクリーニングおよび治療有効性評価のための重要なモデルである。
マウスの腫瘍移植部位は、腫瘍の成長を維持する微小環境を提供し、ヒトで起こるのと同様の転移表現型の選択において重要な役割を果たす。近位リンパ節と脂肪組織の存在は、乳癌15、16,16の疾患進行に影響を与える重要な因子である。ヒト患者において、リンパ節と脂肪組織は、いずれも乳癌,17、18、19,18の悪性腫瘍および罹患率に影響を及ぼす主要な相互作用因子である。19したがって、注射部位の正解剖学的位置の選択は、ヒト疾患と比較して腫瘍モデルの関連性に大きな影響を与える可能性がある。本研究では、主に前述の要件により、第4の乳腺を移植部位として使用し、解剖学的によりアクセスしやすく、操作が容易である。
異なる腫瘍体積計算方法が利用可能であり、研究者は彼らが合うと思う任意を選択することができます。この研究のために選択されたアルゴリズムは、ファウスティーノ・ロチャらによる知見に基づいており、異なる腫瘍体積計算式を比較し、以下の式が最も正確な20であると結論づけた。
基体膜マトリックスは、各種in vitro21およびin vivo22、23,23アッセイにおいて使用される重要な細胞外マトリックスである。異種移植片悪性腫瘍に対する基膜マトリックスの影響に関する矛盾する報告が,22、24、25である。24,22異種移植片の初期の確立にのみ影響を及ぼし、異種移植片の成長にこれ以上の影響を及ぼさないと思われる25.記載された異種移植のために、基体膜マトリックスを癌細胞と混合し、移植前に細胞/ゲル混合溶液粘度を増加させる。基部膜マトリックスの存在は、注入部位からの混合溶液の損失を減少させ、移植部位での混合溶液を維持し、移植された異種移植片容積の均一性を増加させる。
MDA-MB-231細胞株は悪性不死化ヒト乳房腺癌細胞株であり、その三重陰性の状態のために乳癌研究で一般的なツールである。デュアルレポーター(ルシファーゼとGFP)細胞株を使用することで、生体内およびex vivoイメージングの取り扱いにおいてより柔軟に対応できます。生物発光シグナルは、GFP信号よりも感度、深度検出性、優れたコントラスト(シグナル対ノイズ比)を有することが十分に確立されています。このため、全身イメージングに広く使用されているイメージングモダリティです。残念ながら、生物発光検出は、信号検出が線形である狭い時間枠(〜15〜20分後ルシフェリン注射)によって制限されます。動物が安楽死するとBLIシグナルは急速に減少する。これは、多くのマウスを安楽死させる必要があり、複数の組織や臓器を収穫する必要がある場合、実験的な設計上の問題になります。これらの研究では、血液を直接心臓穿刺により採取し、脳、原発腫瘍、肺、および罹患したリンパ節を40匹のマウスで検査した。臓器が収穫され、エキビボイメージングの準備が整う頃には、生物発光シグナルは検出できなかった。したがって、GFP検出は、これらの状況でより適している。GFP信号の発光は可視範囲にあり、これらの波長では、血液(すなわち、ヘモグロビン)による信号吸収が著しく高い。また、NADH、リポ顔料、フラビンによる可視範囲での自己蛍光は、低レベルのGFPシグナルと自己蛍光の背景を区別することが困難になる重要な背景をもたらします。従来のフィルタペアイメージングの代わりにマルチスペクトル蛍光イメージングアプローチを採用し、スペクトル非混合アルゴリズムを使用することで、目的の器官における真のGFP信号を特定するのに役立ちます。したがって、生体内検出と多スペクトルGFPイメージングを生体内で全体での生物発光イメージングの強みを組み合わせることで、マウスの大きなコホートで定量可能なデータを最大化することができます。
動物研究にどのアプローチを選択しても、特に転移性負担を対象とした研究では、臓器/組織の検索前にすべての血液を抽出することを強くお勧めします。このプロトコルは、マウスから得られた全血サンプル(データは示されない)から得られたGFP信号をリアルタイムPCRアッセイにより、同一体型乳癌モデルで検出する。臓器/組織の血液量を最小限に抑えることで、標的臓器の偽陽性シグナルが減少します。
結論として、MDA-MB-231-Luc/GFP細胞を用いた異所性乳癌モデルは、ヒトTNBC患者の状態を密接に模倣する非常に関連性の高い動物モデルである。このモデルは、ヒトと同様の腫瘍微小環境における治療効果の研究、モニタリング、評価に不可欠です。デュアルレポーター細胞株の使用は、この異性所乳癌モデルの実用性をさらに高める。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、国立衛生研究所、国立がん研究所、ベセスダMD、がんと炎症プログラム、フレデリック国立研究所 – 小動物イメージングプログラムの壁内研究プログラムによる支援を認めたいと考えています。レイドスバイオメディカルリサーチ株式会社、フレデリックメリーランド州、米国。
Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
Primer3 | MIT | Primer Design | |
Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |