هذا العمل المسبقة بروتوكول متقدم لتقييم دقيق تحميل الورم عن طريق الكشف عن البروتين الفلوري الأخضر وإشارات الإضاءة الحيوية، فضلا عن التكامل بين تقنية الكشف الجزيئي الكمي.
سرطان الثدي ثلاثي السلبية (TNBC) هو نوع فرعي من سرطان الثدي العدوانية مع خيارات علاجية محدودة. بالمقارنة مع المرضى الذين يعانون من أورام الثدي أقل عدوانية, معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات من مرضى TNBC هو 77% بسبب النمط الظاهري المقاوم للأدوية المميزة وعبء النقيلي. وتحقيقا لهذه الغاية، تم إنشاء نماذج المورين تهدف إلى تحديد استراتيجيات علاجية جديدة تحد من نمو ورم TNBC وانتشار النقيلي. يصف هذا العمل دليلًا عمليًا لنموذج تقويم العظام TNBC حيث يتم زرع خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 المعلقة في مصفوفة غشاء الطابق السفلي في وسادة الدهون الثديية الرابعة ، والتي تحاكي عن كثب سلوك الخلايا السرطانية في البشر. يتم مناقشة قياس الأورام عن طريق الفرجار ، وتقييم الانبثاث الرئوي عبر في الجسم الحي والتصوير الحي السابق ، والكشف الجزيئي. يوفر هذا النموذج منصة ممتازة لدراسة الفعالية العلاجية ومناسب بشكل خاص لدراسة التفاعل بين الورم الأساسي والمواقع النقيلية المنقبة.
سوف تصاب واحدة من كل ثماني نساء تقريباً في الولايات المتحدة بسرطان الثدي الغازي خلال حياتها، وسيتم تشخيص 10%-20% من هؤلاء النساء بنوع سرطان الثدي السلبي العدواني (TNBC). في حين يمكن إزالة الآفات الأولية جراحيًا في معظم الحالات ، فإن التنابث دون السريري والمقاومة الكيميائية يجعلانه مرضًا مستعصيًا. الأهم من ذلك، فإن معظم المرضى الذين يعانون من TNBC النقيلي ينتكسون في نهاية المطاف، حتى لو خضعوا للعلاج في المرحلة المبكرة1. وبالتالي، فإن عدم تجانس السرطان، والانبثاث المجهري، والمقاومة العلاجية هي ثلاثة تحديات رئيسية تحد من النتيجة السريرية الناجحة لمرضى TNBC. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لفهم أفضل للخلفية الجزيئية متعددة الأشكال من TNBC وتطوير عوامل علاجية فعالة تحد من الأمراض النقيلية.
الانبثاث الورم هو عملية متعددة الخطوات حيث تتحكم الخلية السرطانية وتغتصب بيئتها الدقيقة لتعزيز انتشارها الخاص عبر تدهور الأغشية وهروب الخلايا السرطانية من الآفة الأولية ، عن طريق الدخول إلى (أي intravasation) والخروج من (أي المنفرة) الأوعية الدموية ، وفي نهاية المطاف التكيف والاستعمار داخل أسرة الأنسجة المنتفخة2. وقد وضعت نماذج الحيوان لدراسة سرطان الثدي الانبثاث، حيث يتم تنفيذ منهجيتين عادة: الحقن المباشر للدورة الدموية وزرع تقويم الأسنان. طرق شائعة الاستخدام لحقن الدورة الدموية المباشرة تشمل حقن الوريد الذيل, في حين أن النهج الأخرى بما في ذلك حقن القلب المباشر3,حقن الدماغ المباشر4,وحقن الكبد المباشر5 كما تم استخدامها. غالبًا ما يشار إلى حقن الدورة الدموية المباشرة على أنها نموذج انبثاث اصطناعي ، وهو سريع وسهل ولكنه أقل دقة من الناحية الفسيولوجية لأنه يتحايل على هروب الورم من الآفة الأولية والعضم اللاف6،7،8. بالمقارنة مع نماذج الحقن المباشر ، يستغرق نموذج سرطان الثدي التقويمي وقتًا أطول لحدوث آفات النقيلية يمكن اكتشافها في الأعضاء النائية مثل الرئة ، ولكنه أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لأنه يحاكي عن كثب عملية النقيلي المتعددة الخطوات كما يحدث في البشر. الأهم من ذلك، قارنت دراسةأجريت عام 2013 حقن ووين الذيل ونماذج تقويم الأسنان ووجدت أن خلايا سرطان الثدي حقنت في الوريد الذيل وتلك المعزولة من الآفات النقيلية الرئة بعد حقن الوريد الذيل أظهرت ملامح التعبير الجيني العالمية مماثلة. في المقابل، كان الملف العالمي للتعبير الجيني لخلايا سرطان الثدي التي حقنت بتقويم موضعي مختلفة بشكل كبير عن تلك التي من الآفات النقيلي الرئة الناشئة عن الخلايا حقن تتقويم موضعي9. تشير هذه الملاحظات إلى أن نموذج تقويم الأسنان أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية ، لأن الآفات النقيلية تخضع لعملية اختيار مماثلة لعملية الانبثاث المتعددة الخطوات كما يحدث في البشر.
يصف هذا العمل نموذج سرطان الثدي التقويمي (MDA-MB-231-Luc/GFP) في الفئران العارية التي تم تحسينها في مختبرنا لتقنيات الكشف عن التصوير وكذلك تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة وتطوير عوامل العلاج الكيميائي المستهدفة.
لدراسة TNBC في الحيوانات، وقد وضعت نموذجين من المورين: الخلايا غدية الثدي الثدي MDA-MB-231 الإنسان في الفئران المحصنة (أي الفئران عارية الأنهيميك، الفئران NSG)، و 4T1 في الفئران BALB / ج المناعة المختصة. كلا النموذجين لها مزاياها. يعتمد اختيار النموذج الحيواني للدراسة على أهداف البحث. على سبيل المثال، نموذج MDA-MB-231 هو خط خلية TNBC الإنسان نمت في الفئران المنقوصة المناعية التي تحاكي مرضى سرطان الثدي البشري المثبطة للمناعة. من ناحية أخرى ، فإن النمط الظاهري الغازي لخلايا سرطان الثدي ثلاثية السلبية 4T1 في الفئران BALB / c يحاكي عن كثب العملية النقيلية كما يحدث في المرحلة الرابعة من مرضى سرطان الثدي البشري. على عكس نهج حقن الخلايا الوريدية، تم حقن خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 على نحو مماثل في وسادة الدهون الثديية11،12 في نموذج سرطان الثدي التقويمي11،13. ويعد نمو الورم والقدرة النقيلي المكتسبة أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية، وبالتالي فإنه ليس نموذج سرطان النقيلي الاصطناعي4,,14. مثل هذا النموذج الانبثاث التلقائي يحاكي عن كثب تطور سرطان الثدي البشري باستثناء مرحلة البدء. هذا هو نموذج حاسم لفحص المخدرات في الجسم الحي وتقييم الفعالية العلاجية في سرطان الثدي النقيلي.
موقع زرع الورم في الماوس يلعب دورا حاسما في توفير بيئة صغيرة تحافظ على نمو الورم واختيار النمط الظاهري النقيلي مماثلة لتلك التي تحدث في البشر. العقدة الليمفاوية القريبة ووجود الأنسجة الدهنية هي العوامل الرئيسية التي تؤثر على تطور مرض سرطان الثدي15،16. في المريض البشري ، فإن العقدة الليمفاوية والأنسجة الدهنية كلاهما من العوامل الرئيسية المتفاعلة التي تؤثر على خبيثة وحدوث سرطان الثدي17،18،19. وبالتالي ، فإن اختيار الموقع التشريحي الصحيح لموقع الحقن يمكن أن يؤثر بشكل كبير على أهمية نموذج الورم مقارنة بالمرض البشري. استخدمت هذه الدراسة الغدة الثديية الرابعة كموقع زرع ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى المتطلبات المذكورة أعلاه وأنه من الناحية التشريحية أكثر سهولة وأسهل للتلاعب.
تتوفر طرق مختلفة لحساب حجم الورم، ويمكن للباحث اختيار أي طريقة يراها مناسبة. تستند الخوارزمية المختارة لهذه الدراسة إلى النتائج التي توصل إليها فاوستينو-روشا وآخرون، الذين قارنوا صيغ حساب حجم الورم المختلفة وخلصوا إلى أن الصيغة أدناه هي الأكثر دقة20.
مصفوفة غشاء الطابق السفلي هو مصفوفة غير خلوية هامة تستخدم في مختلف في المختبر21 وفي الجسم الحي22،23 المقالات. هناك تقارير متناقضة22،24،25 بشأن تأثير مصفوفة غشاء الطابق السفلي على الأورام الخبيثة xenograft. يبدو أن تؤثر فقط على إنشاء الأولية للxenograft وليس لها أي تأثير آخر على نمو xenograft25. لزرع xenograft وصفها، تم خلط مصفوفة غشاء الطابق السفلي مع الخلايا السرطانية لزيادة لزوجة حل الخلية / هلام مزيج قبل الزرع. وجود مصفوفة غشاء الطابق السفلي يقلل من فقدان محلول المزيج من موقع الحقن ويحافظ على محلول المزيج في موقع الزرع ، وبالتالي زيادة توحيد حجم xenograft المزروعة.
خط الخلية MDA-MB-231 هو خط خلية غدي الثدي البشري الخلد الخبيث وهو أداة شعبية في أبحاث سرطان الثدي بسبب حالته الثلاثية السلبية. يسمح استخدام خط الخلية المزدوج (luciferase و GFP) بمزيد من المرونة في التعامل مع التصوير في الجسم الحي والتصوير بالجسم الحي السابق. ومن الثابت أن إشارة الإضاءة الحيوية تمتلك حساسية أكبر، وإمكانية الكشف عن العمق، وتباين فائق (نسبة الإشارة إلى الضوضاء) من إشارات GFP. وبسبب هذا، هو طريقة التصوير المستخدمة على نطاق واسع لتصوير الجسم كله. لسوء الحظ، فإن الكشف عن الإضاءة الحيوية محدود بنافذة زمنية ضيقة (~ 15-20 دقيقة بعد حقن لوسيفيرين) يكون خلالها الكشف عن الإشارة خطيًا. إشارة BLI تتضاءل بسرعة عندما يتم القتل الرحيم للحيوانات. هذا يصبح مسألة تصميم تجريبي إذا كان العديد من الفئران تحتاج إلى القتل الرحيم وحصاد أنسجة متعددة أو أعضاء مطلوب. في هذه الدراسات، تم حصاد الدم عن طريق ثقب القلب المباشر، تم فحص الدماغ والورم الأساسي والرئة والعقدة الليمفاوية المتضررة في 40 الفئران. بحلول الوقت الذي تم حصاد الأعضاء وعلى استعداد للتصوير على سبيل الحمراء، كانت إشارة الإضاءة الحيوية غير قابلة للكشف. لذلك، الكشف عن GFP هو أكثر ملاءمة في هذه الحالات. إن انبعاث إشارة GFP هو في النطاق المرئي ، وعند هذه الأطوال الموجية ، يكون امتصاص الإشارة بسبب الدم (أي الهيموغلوبين) أعلى بكثير. أيضا، autofluorescence في النطاق المرئي بسبب NADH، أصباغ الدهون، وفلافين النتائج في خلفية كبيرة التي تجعل من الصعب التمييز بين إشارة GFP منخفضة المستوى وخلفية autofluorescence. يساعد استخدام نهج تصوير الفلورسينس متعدد الأطياف بدلاً من التصوير التقليدي لزوج الفلتر واستخدام خوارزميات فك الخلط الطيفية على تحديد إشارة GFP الحقيقية في العضو موضع الاهتمام. وبالتالي ، من خلال الجمع بين نقاط القوة من التصوير الإضاءة الحيوية في الجسم كله في الكشف عن الجسم الحي والتصوير GFP متعددة الأطياف في تقييمات الجهاز / الأنسجة على الجسم الحي ، يمكن تعظيم البيانات القابلة للقياس الكمي في مجموعة كبيرة من الفئران.
بغض النظر عن النهج الذي يتم اختياره لدراسة الحيوانات ، يوصى بشدة باستخراج جميع الدم قبل استرجاع الأعضاء / الأنسجة ، خاصة بالنسبة للدراسات التي تستهدف العبء النقيلي. يكتشف هذا البروتوكول إشارات GFP من عينات الدم الكاملة التي تم الحصول عليها من الفئران (البيانات غير الموضحة) في نموذج سرطان الثدي التقويمي بواسطة اختبارات PCR في الوقت الحقيقي. تقليل حجم الدم في الأعضاء / الأنسجة سوف يقلل من الإشارة الإيجابية الكاذبة في الأعضاء المستهدفة.
في الختام، نموذج سرطان الثدي التقويمي ة باستخدام خلايا MDA-MB-231-Luc/GFP هو نموذج الحيوان ذات الصلة للغاية التي تحاكي عن كثب حالة المريض TNBC الإنسان. هذا النموذج ضروري لدراسة ورصد وتقييم الفعالية العلاجية في بيئة ورم صغيرة مماثلة للبشر. استخدام خطوط الخلية المراسل المزدوج يعزز من التطبيق العملي لهذا النموذج سرطان الثدي تقويم الرحم.
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون أن ينوهوا بدعم برنامج البحوث الداخلية للمعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان، ومؤسسة Bethesda MD، وبرنامج السرطان والالتهاب، ومختبر فريدريك الوطني – برنامج التصوير الحيواني الصغير، Leidos البحوث الطبية الحيوية ، وشركة ، فريدريك ميريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية.
Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
Primer3 | MIT | Primer Design | |
Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |