Эта работа предустанавливает передовой протокол для точной оценки нагрузки опухоли путем обнаружения зеленого флуоресцентного белка и биолюминесценции сигналов, а также интеграции метода количественного молекулярного обнаружения.
Тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC) является агрессивным подтипом рака молочной железы с ограниченными терапевтическими возможностями. По сравнению с пациентами с менее агрессивными опухолями молочной железы, 5-летняя выживаемость пациентов TNBC составляет 77% из-за их характерного лекарственно-устойчивого фенотипа и метастатического бремени. С этой целью были созданы моделя мочеиспускательного фактора, направленные на выявление новых терапевтических стратегий, ограничивающих рост опухоли TNBC и метастатическое распространение. Эта работа описывает практическое руководство для модели ортотопических TNBC, где MDA-MB-231 раковые клетки молочной железы приостановлено в подвале мембраны матрицы имплантируются в четвертом молочной жирной площадки, которая тесно имитирует поведение раковых клеток у людей. Измерение опухолей по калибру, оценка метастазов легких с помощью in vivo и ex vivo изображений, а также молекулярное обнаружение. Эта модель обеспечивает отличную платформу для изучения терапевтической эффективности и особенно подходит для изучения взаимодействия между первичной опухолью и дистальными метастатическими участками.
Приблизительно у одной из восьми женщин в Соединенных Штатах в течение своей жизни будет развиваться инвазивный рак молочной железы, и 10%-20% этих женщин будут диагностированы с агрессивным тройным отрицательным раком молочной железы (TNBC) подтипом. В то время как первичные поражения могут быть удалены хирургическим путем в большинстве случаев, субклинический микрометастаз и химиорезделает делают его неразрешимым заболеванием. Важно отметить, что большинство пациентов с метастатическим TNBC в конечном итоге рецидив, даже если они прошли лечение в ранней стадии1. Таким образом, неоднородность рака, микрометастаз и терапевтическая устойчивость являются тремя основными проблемами, ограничивающими успешные клинические результаты пациентов TNBC. Следовательно, существует настоятельная необходимость лучше понять полиморфный молекулярный фон TNBC и разработать эффективные терапевтические агенты, которые ограничивают метастатическое заболевание.
Метастазопухоли опухоли является многоступенчатый процесс, где опухолевые клетки контролирует и узурпирует свою микросреду, чтобы содействовать своему собственному распространению через деградацию мембраны и опухолевые клетки бежать от первичного поражения, через вход в (т.е. интравазация) и выход из (т.е. экстравазация) сосуды, и в конечном итоге адаптации и колонизации в дистримуляции2. Модели животных были разработаны для изучения метастазов рака молочной железы, где обычно внедряются две методологии: прямая инъекция кровообращения и ортотопическая имплантация. Обычно используемые методы для прямого инъекции кровообращения включают инъекции хвостовой вена, в то время как другие подходы, включая прямую инъекцию сердца3, прямой инъекции мозга4, и прямой инъекции печени5 также были использованы. Прямая инъекция кровообращения часто называют моделью искусственного метастаза, которая быстра и проста, но менее физиологически точна, потому что обходит опухоль от первичного поражения и интравазации6,,7,8. По сравнению с прямыми моделями инъекций, ортотопическая модель рака молочной железы занимает больше времени для возникновения обнаруживаемых метастатических поражений в отдаленных органах, таких как легкие, но это более физиологически актуально, потому что она тесно имитирует многоступенчатый метастатический процесс, как это происходит у людей. Важно отметить, что исследование 2013 года9 сравнило инъекцию хвостовой вены и ортотопические модели и обнаружило, что раковые клетки молочной железы вводятся в хвостовую вену, а те, которые изолированы от метастатических поражений легких после инъекции хвостовой вена, продемонстрировали аналогичные глобальные профили экспрессии генов. В отличие от этого, глобальный профиль экспрессии генов ортотопически вводили клетки рака молочной железы резко отличается от метастатических поражений легких, возникающих из ортотопически вводили клетки9. Эти наблюдения показывают, что ортотопическая модель более физиологически актуальна, потому что метастатические поражения проходят процесс отбора, аналогичный многоступенчатому процессу метастаза, как это происходит у людей.
Эта работа описывает ортотопический рак молочной железы (MDA-MB-231-Luc/GFP) модель в обнаженных мышей, которая была оптимизирована в нашей лаборатории для методов обнаружения изображений, а также выявление новых биомаркеров и развитие целевых химиотерапевтических агентов.
Для изучения TNBC у животных были разработаны две модели мурин: MDA-MB-231 клеток аденокарциномы молочной железы человека у иммунно-компрометированных мышей (т.е. агимических обнаженных мышей, NSG мышей), и 4T1 у иммунокомпетентных МЫшей BALB/c. Обе модели имеют свои преимущества. Выбор модели животного для исследования зависит от целей исследования. Например, модель MDA-MB-231 представляет собой человеческую клеточную линию TNBC, выращенную у мышей с ослабленным иммунитетом, которая имитирует иммунодепрессированных больных раком молочной железы человека. С другой стороны, инвазивный фенотип ортотопических 4T1 тройной отрицательный морин раковых клеток молочной железы у мышей BALB/c тесно имитирует метастатический процесс, как это происходит в стадии IV больных раком молочной железы человека. В отличие от внутривенных инъекционных клеток подход, человека MDA-MB-231 раковые клетки молочной железы были аналогичным образом введены в молочной жировой площадки11,12 в ортотопической модели рака молочной железы11,13. Чем дольше рост опухоли и приобретенные метастатические способности более физиологически актуальны, таким образом, это не искусственный метастатический рак модель4,14. Такая модель спонтанного метастаза тесно имитирует развитие рака молочной железы человека, за исключением стадии инициации. Это важнейшая модель для скрининга препарата In vivo и терапевтической оценки эффективности при метастатическом раке молочной железы.
Место имплантации опухоли в мыши играет решающую роль в обеспечении микросреды, которая поддерживает рост опухоли и выбор метастатического фенотипа, аналогичного тому, что происходит у людей. Проксимальный лимфатический узло и наличие жировой ткани являются ключевыми факторами, влияющими на прогрессирование заболевания раком молочной железы15,16. У пациента, лимфатический узла и жировой ткани являются ключевыми взаимодействующими факторами, влияющими на злокачественность и заболеваемость раком молочной железы17,18,19. Таким образом, выбор правильного анатомического расположения для места инъекции может сильно повлиять на релевантность опухолевой модели по сравнению с болезнью человека. В этом исследовании использовалась четвертая молочной железы в качестве места имплантации главным образом из-за вышеупомянутых требований и что она анатомически более доступна и проще в использовании.
Различные методы расчета объема опухоли доступны, и исследователь может выбрать любой, что они считают нужным. Алгоритм, выбранный для этого исследования, основан на выводах Фаустино-Роши и др., который сравнил различные формулы расчета объема опухоли и пришел к выводу, что формула ниже является наиболее точной20.
Подвал мембранной матрицы является важной внеклеточной матрицы, используемой в различных in vitro21 и in vivo22,23 анализов. Есть противоречивые сообщения22,24,25 о влиянии мембранной матрицы подвала на злокачественность ксенотрансплантата. Это, кажется, только влияют на первоначальное создание ксенотрансплантата и не имеют дальнейшего влияния на рост ксенотрансплантата25. Для ксенотрансплантата имплантации описано, подвал мембраны матрицы была смешана с раковыми клетками, чтобы увеличить клеточной / гель микс раствора вязкости до имплантации. Наличие мембранной матрицы в подвале уменьшает потерю раствора смеси из места инъекции и удерживает раствор смеси в месте имплантации, тем самым увеличивая однородность имплантированного объема ксенотрансплантата.
Линия клеток MDA-MB-231 является злокачественной увековеченной аденокарциномой клеточной линии молочной железы человека и является популярным инструментом в исследованиях рака молочной железы из-за его тройного отрицательного статуса. Использование двойной репортеров (люциферазы и GFP) клеточной линии позволяет большую гибкость в обработке in vivo и ex vivo изображений. Хорошо известно, что биолюминесценционный сигнал обладает большей чувствительностью, глубиной и превосходным контрастом (соотношение сигнала к шуму), чем сигналы GFP. Из-за этого, это широко используемая модальность изображения для всего тела изображения. К сожалению, обнаружение биолюминесценции ограничено узким временной окном (15–20 минут после инъекции люциферина), в течение которого обнаружение сигнала является линейным. BlI сигнал быстро уменьшается, когда животные усыплены. Это становится экспериментальной проблемой дизайна, если многие мыши должны быть усыплены и уборки нескольких тканей или органов не требуется. В этих исследованиях кровь была собрана путем прямого прокола сердца, мозг, первичная опухоль, легкие, и пораженные лимфатические узлы были исследованы у 40 мышей. К тому времени, когда органы были собраны и готовы к изображению ex vivo, сигнал биолюминесценции был необнаружен. Таким образом, обнаружение GFP более подходит в таких ситуациях. Выброс сигнала GFP находится в видимом диапазоне, и при этих длинах волн поглощение сигнала за счет крови (т.е. гемоглобина) значительно выше. Кроме того, автофлуоресценция в видимом диапазоне из-за NADH, липопигментов и флавинов приводит к значительному фону, что затрудняет различение между низкоуровневым сигналом GFP и фоном автофлюоресценции. Использование многоспектрального подхода к визуализации флуоресценции вместо традиционной визуализации фильтр-пары и использование спектральных алгоритмов несмешивания помогает определить истинный сигнал GFP в интересуемом органе. Таким образом, путем объединения сильных биолюминесценции изображения во всем теле in vivo обнаружения и многоспектральных GFP изображений в ex vivo органа / ткани оценки, количественные данные могут быть максимально в большой когорте мышей.
Независимо от того, какой подход выбран для исследования на животных, извлечение всей крови до извлечения органов / ткани настоятельно рекомендуется, особенно для исследований, направленных на метастатическое бремя. Этот протокол обнаруживает сигналы GFP от всего образца крови, полученные от мышей (данные не показаны) в ортотопической модели рака молочной железы в режиме реального времени ПЦР-анализов. Минимизация объема крови в органах/тканях уменьшит ложноположительный сигнал в органах-мишенях.
В заключение, ортотопические модели рака молочной железы с использованием MDA-MB-231-Luc / GFP клетки является весьма актуальной модели животных, которые тесно имитируют человека TNBC состояние пациента. Эта модель имеет важное значение для изучения, мониторинга и оценки терапевтической эффективности в микросреде опухоли, похожей на человека. Использование двойной репортер клеточной линии еще больше повышает практичность этой ортотопической модели рака молочной железы.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы отметить поддержку Программы интрамуральных исследований Национальных институтов здравоохранения, Национального института рака, Bethesda MD, программы рака и воспаления, и Национальной лаборатории Фредерика – Программа визуализации малых животных, Лейдос биомедицинских исследований, Inc, Фредерик Мэриленд, США.
Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
Primer3 | MIT | Primer Design | |
Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |