Questo lavoro preconfigura un protocollo avanzato per valutare con precisione il carico del tumore rilevando segnali di proteina fluorescente e bioluminescenza verdi, nonché l’integrazione della tecnica di rilevamento molecolare quantitativo.
Il carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) è un sottotipo di cancro al seno aggressivo con opzioni terapeutiche limitate. Rispetto ai pazienti con tumori al seno meno aggressivi, il tasso di sopravvivenza a 5 anni dei pazienti TNBC è del 77% a causa del loro caratteristico fenotipo farmacoresistente e del carico metastatico. A tal fine, sono stati stabiliti modelli murini volti a identificare nuove strategie terapeutiche che limitano la crescita del tumore TNBC e la diffusione metastatica. Questo lavoro descrive una guida pratica per il modello ortotopico TNBC in cui le cellule del cancro al seno MDA-MB-231 sospese in una matrice di membrana seminterrato sono impiantate nel quarto cuscinetto di grasso mammario, che imita da vicino il comportamento delle cellule tumorali negli esseri umani. Vengono discusse la misurazione dei tumori per calibro, la valutazione della metastasi polmonare tramite imaging in vivo ed ex vivo e il rilevamento molecolare. Questo modello fornisce un’eccellente piattaforma per studiare l’efficacia terapeutica ed è particolarmente adatto per lo studio dell’interazione tra il tumore primario e siti metastatici distali.
Circa una donna su otto negli Stati Uniti svilupperà un cancro al seno invasivo durante la sua vita, e il 10%-20% di queste donne sarà diagnosticato con il sottotipo aggressivo di cancro al seno triplo negativo (TNBC). Mentre le lesioni primarie possono essere rimosse chirurgicamente nella maggior parte dei casi, la micrometastasi subclinica e la chemoresistance lo rendono una malattia intrattabile. È importante sottolineare che la maggior parte dei pazienti con TNBC metastatico alla fine ricaduta, anche se hanno subito un trattamento nella fase iniziale1. Pertanto, l’eterogeneità del cancro, la micrometastasi e la resistenza terapeutica sono tre sfide principali che limitano l’esito clinico di successo dei pazienti Affetti da TNBC. Pertanto, vi è un urgente bisogno di comprendere meglio lo sfondo molecolare polimorfico della TNBC e sviluppare efficaci agenti terapeutici che limitano la malattia metastatica.
La metastasi tumorale è un processo multifase in cui la cellula tumorale controlla e usurpa il suo microambiente per promuovere la propria diffusione attraverso la degradazione della membrana e la fuga delle cellule tumorali dalla lesione primaria, tramite l’ingresso (cioè, l’intravasazione) e l’uscita dalla (cioè, stravasazione) la vascolatura, e infine l’adattamento e la colonizzazione all’interno dei letti di tessuto distal2. Sono stati sviluppati modelli animali per studiare la metastasi del cancro al seno, dove sono comunemente implementate due metodologie: iniezione diretta di circolazione sanguigna e impianto ortotopico. I metodi comunemente impiegati per l’iniezione diretta di circolazione sanguigna includono l’iniezione di vene della coda, mentre sono stati impiegati anche altri approcci tra cui l’iniezione cardiaca diretta3, l’iniezione diretta del cervello4e l’iniezione diretta del fegato5. L’iniezione diretta di circolazione sanguigna è spesso indicata come un modello di metastasi artificiale, che è veloce e facile ma meno fisiologicamente preciso perché elude la fuga tumorale dalla lesione primaria e dall’intravasation6,7,8. Rispetto ai modelli a iniezione diretta, il modello di cancro al seno ortotopico richiede più tempo per l’insorgenza di lesioni metastatiche rilevabili in organi remoti come il polmone, ma è più fisiologicamente rilevante perché imita da vicino il processo metastatico multifase come si verifica negli esseri umani. È importante sottolineare che uno studio del 20139 ha confrontato l’iniezione di vene della coda e i modelli ortotopici e ha scoperto che le cellule del cancro al seno iniettate nella vena della coda e quelle isolate dalle lesioni metastatiche polmonari dopo l’iniezione di vena della coda hanno mostrato profili di espressione genica globale simili. Al contrario, il profilo di espressione genica globale delle cellule del cancro al seno iniettate ortotopicamente era drammaticamente diverso da quello delle lesioni metastatiche polmonari derivanti da cellule iniettate ortotopicamente9. Queste osservazioni suggeriscono che il modello ortotopico è più fisiologicamente rilevante, perché le lesioni metastatiche subiscono un processo di selezione simile al processo multifase della metastasi come si verifica negli esseri umani.
Questo lavoro descrive un modello di cancro al seno ortotopico (MDA-MB-231-Luc/GFP) in topi nudi che è stato ottimizzato nel nostro laboratorio per le tecniche di rilevamento dell’imaging, nonché l’identificazione di nuovi biomarcatori e lo sviluppo di agenti chemioterapici mirati.
Per lo studio della TNBC negli animali, sono stati sviluppati due modelli murini: le cellule adenocarcinoma mammario umano MDA-MB-231 in topi immunocompromessi (ad es. topi nudi atimici, topi NSG) e il 4T1 in topi BALB/c immuno-competenti. Entrambi i modelli hanno i loro vantaggi. La scelta del modello animale per uno studio dipende dagli obiettivi di ricerca. Ad esempio, il modello MDA-MB-231 è una linea cellulare TNBC umana coltivata in topi immunocompromessi che imita pazienti affetti da cancro al seno umano immunosoppressi. D’altra parte, il fenotipo invasivo delle cellule di cancro al seno del murino ortotopico 4T1 triplo negativo nei topi BALB/c imita da vicino il processo metastatico in quanto si verifica nei pazienti affetti da cancro al seno umano in fase IV. A differenza dell’approccio di iniezione cellulare per via endovenosa, le cellule di cancro al seno MDA-MB-231 sono state iniettate allo stesso modo nel cuscinetto di grasso mammario11,12 nel modello di cancro al seno ortotopico11,13. La crescita del tumore più lunga e la capacità metastatica acquisita è più fisiologicamente rilevante, quindi non è un modello di cancro metastatico artificiale4,14. Tale modello spontaneo di metastasi imita da vicino lo sviluppo del cancro al seno umano ad eccezione della fase di avvio. Si tratta di un modello cruciale per lo screening farmacologico in vivo e la valutazione dell’efficacia terapeutica nel cancro al seno metastatico.
Il sito di impianto del tumore nel topo svolge un ruolo cruciale nel fornire un microambiente che sostiene la crescita del tumore e la selezione del fenotipo metastatico simile a quello che si verifica negli esseri umani. Il linfonodo prossimale e la presenza di tessuto adiposo sono i fattori chiave che influenzano la progressione della malattia del cancro al seno15,16. In un paziente umano, il linfonodo e il tessuto adiposo sono entrambi fattori interagenti chiave che influenzano la malignità e l’incidenza del cancro al seno17,18,19. Così, la selezione della corretta posizione anatomica per il sito di iniezione può influenzare fortemente la rilevanza del modello tumorale rispetto alla malattia umana. Questo studio ha usato la quarta ghiandola mammaria come sito di impianto principalmente a causa dei suddetti requisiti e che è anatomicamente più accessibile e più facile da manipolare.
Diversi metodi di calcolo del volume del tumore sono disponibili, e un ricercatore può scegliere quello che ritengono opportuno. L’algoritmo scelto per questo studio si basa sui risultati di Faustino-Rocha et al., che ha confrontato diverse formule di calcolo del volume tumorale e ha concluso che la formula qui sotto è la più accurata20.
La matrice della membrana del seminterrato è un’importante matrice extracellulare utilizzata in vari in vitro21 e in vivo22,,23 saggi. Ci sono rapporti contraddittori22,24,25 per quanto riguarda l’influenza della matrice di membrana seminterrato sulla malignità xenotrapianto. Sembra influenzare solo l’istituzione iniziale dello xenotrapianto e non ha ulteriori effetti sulla crescita dello xenotrapianto25. Per l’impianto di xenotrapianto descritto, la matrice della membrana del seminterrato è stata mescolata con le cellule tumorali per aumentare la viscosità del mix di cellule/gel prima dell’impianto. La presenza della matrice della membrana del seminterrato riduce la perdita di soluzione di miscelazione dal sito di iniezione e mantiene la soluzione di miscelazione presso il sito di impianto, aumentando così l’uniformità del volume di xenotrapianto impiantato.
La linea cellulare MDA-MB-231 è una linea maligna immortalata di adenocarcinoma umano ed è uno strumento popolare nella ricerca sul cancro al seno a causa del suo stato triplo negativo. L’uso della linea cellulare dual reporter (luciferase e GFP) consente una maggiore flessibilità nella gestione dell’imaging in vivo ed ex vivo. È ben noto che il segnale di bioluminescenza possiede una maggiore sensibilità, rilevabilità della profondità e contrasto superiore (rapporto segnale-rumore) rispetto ai segnali GFP. Per questo motivo, è una modalità di imaging ampiamente utilizzata per l’imaging di tutto il corpo. Sfortunatamente, il rilevamento della bioluminescenza è limitato da una stretta finestra temporale (15-20 min dopo l’iniezione di luciferina) durante la quale il rilevamento del segnale è lineare. Il segnale BLI diminuisce rapidamente quando gli animali sono eutanasia. Questo diventa un problema di progettazione sperimentale se molti topi devono essere eutanasia e la raccolta di più tessuti o organi è necessaria. In questi studi, il sangue è stato raccolto da puntura cardiaca diretta, il cervello, tumore primario, polmone, e linfonodo interessato sono stati esaminati in 40 topi. Quando gli organi sono stati raccolti e pronti per l’imaging ex vivo, il segnale di bioluminescenza non era rilevabile. Pertanto, il rilevamento GFP è più adatto in queste situazioni. L’emissione del segnale GFP è nella portata visibile, e a queste lunghezze d’onda, l’assorbimento del segnale a causa del sangue (cioè l’emoglobina) è significativamente più alto. Inoltre, l’autofluorescenza nella gamma visibile a causa di NADH, lipo-pigmenti e flanella si traduce in uno sfondo significativo che rende difficile distinguere tra un segnale GFP di basso livello e uno sfondo autofluorescenza. L’utilizzo di un approccio di imaging a fluorescenza multispettrale invece dell’imaging tradizionale a coppie di filtri e l’utilizzo di algoritmi di disinsamento spettrale aiuta a identificare il vero segnale GFP nell’organo di interesse. Quindi, combinando i punti di forza dell’imaging a bioluminescenza nel rilevamento di tutto il corpo in vivo e l’imaging GFP multispettrale nelle valutazioni di organi/tessuti ex vivo, i dati quantificabili possono essere massimizzati in una grande coorte di topi.
Non importa quale approccio è selezionato per uno studio animale, l’estrazione di tutto il sangue prima del recupero di organi / tessuti è altamente raccomandato, soprattutto per gli studi mirati al carico metastatico. Questo protocollo rileva i segnali GFP provenienti dall’intero campione di sangue ottenuto dai topi (dati non mostrati) nel modello di cancro al seno ortotopico dai test PCR in tempo reale. Ridurre al minimo il volume sanguigno negli organi/tessuti ridurrà il segnale falso positivo negli organi bersaglio.
In conclusione, il modello di cancro al seno ortotopico che utilizza le cellule MDA-MB-231-Luc/GFP è un modello animale altamente rilevante che imita da vicino la condizione del paziente TNBC umano. Questo modello è essenziale per studiare, monitorare e valutare l’efficacia terapeutica in un microambiente tumorale simile agli esseri umani. L’uso di linee cellulari a doppio reporter migliora ulteriormente la praticità di questo modello di cancro al seno ortotopico.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano riconoscere il sostegno del Programma di Ricerca Intramurale degli Istituti Nazionali di Salute, del National Cancer Institute, del Bethesda MD, del Programma Cancro e Infiammazione e del Frederick National Laboratory – Small Animal Imaging Program, Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Maryland, Stati Uniti.
Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
Primer3 | MIT | Primer Design | |
Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |