Diese Arbeit setzt ein fortschrittliches Protokoll vor, um die Tumorbelastung durch den Nachweis von grünen Fluoreszenzprotein- und Biolumineszenzsignalen sowie die Integration quantitativer molekularer Detektionstechniken genau zu bewerten.
Dreifach-negativer Brustkrebs (TNBC) ist ein aggressiver Brustkrebs-Subtyp mit begrenzten therapeutischen Möglichkeiten. Im Vergleich zu Patienten mit weniger aggressiven Brusttumoren liegt die 5-Jahres-Überlebensrate von TNBC-Patienten aufgrund ihres charakteristischen medikamentenresistenten Phänotyps und ihrer metastasierenden Belastung bei 77 %. Zu diesem Zweck wurden murine Modelle etabliert, die darauf abzielen, neue therapeutische Strategien zu identifizieren, die das TNBC-Tumorwachstum und die metastasierende Ausbreitung begrenzen. Diese Arbeit beschreibt einen praktischen Leitfaden für das Orthotop-Modell TNBC, bei dem MDA-MB-231-Brustkrebszellen, die in einer Kellermembranmatrix ausgesetzt sind, in das vierte Brustfettpad implantiert werden, das das Verhalten von Krebszellen beim Menschen genau nachahmt. Die Messung von Tumoren mittels Sättel, die Beurteilung der Lungenmetastasen mittels In-vivo- und Ex-vivo-Bildgebung sowie die molekulare Detektion werden diskutiert. Dieses Modell bietet eine hervorragende Plattform, um die therapeutische Wirksamkeit zu untersuchen und eignet sich besonders für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen dem primären Tumor und distalen metastasierenden Stellen.
Etwa eine von acht Frauen in den Vereinigten Staaten wird im Laufe ihres Lebens an invasivem Brustkrebs erkranken, und 10 % dieser Frauen werden mit dem aggressiven subtyp dreifach negativen Brustkrebs (TNBC) diagnostiziert. Während primäre Läsionen in den meisten Fällen operativ entfernt werden können, machen die subklinische Mikrometastasen und Die Chemoresistenz sie zu einer unlösbaren Krankheit. Wichtig ist, dass die meisten Patienten mit metastasierendem TNBC schließlich einen Rückfall erleiden, auch wenn sie sich im frühen Stadium1einer Behandlung unterzogen haben. Daher sind Krebsheterogenität, Mikrometastasierung und therapeutische Resistenz drei große Herausforderungen, die das erfolgreiche klinische Ergebnis von TNBC-Patienten begrenzen. Daher ist es dringend notwendig, den polymorphen molekularen Hintergrund von TNBC besser zu verstehen und wirksame therapeutische Wirkstoffe zu entwickeln, die metastasierende Erkrankungen begrenzen.
Tumormetastasierung ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem die Tumorzelle ihre Mikroumgebung steuert und an sich zieht, um ihre eigene Verbreitung durch Membranabbau und Tumorzellflucht aus der primären Läsion zu fördern, durch Eintritt in (d. h. Intravasation) und Ausstieg aus (d.h. Extravasation) der Vaskulatur und letztlich Anpassung und Besiedlung in distalen Gewebebetten2. Tiermodelle wurden entwickelt, um Brustkrebsmetastasen zu untersuchen, bei denen zwei Methoden häufig umgesetzt werden: direkte Blutzirkulationsinjektion und orthotopische Implantation. Häufig eingesetzte Methoden für die direkte Blutzirkulation Injektion gehören Schwanz Vene Injektion, während andere Ansätze einschließlich direkte Herz-Injektion3, direkte Gehirninjektion4, und direkte Leberinjektion5 wurden auch verwendet. Die direkte Blutzirkulationsinjektion wird oft als künstliches Metastasenmodell bezeichnet, das schnell und einfach, aber weniger physiologisch genau ist, weil es die Tumorflucht aus der primären Läsion und Intravasation6,7,8umgeht. Im Vergleich zu Direktinjektionsmodellen dauert das orthotopische Brustkrebsmodell länger für das Auftreten nachweisbarer metastasierender Läsionen in entfernten Organen wie der Lunge, ist aber physiologisch relevanter, da es den mehrstufigen metastasierenden Prozess, wie er beim Menschen auftritt, eng imitiert. Wichtig ist, dass eine Studie9 aus dem Jahr 2013 die Injektion der Schwanzvene und orthotopische Modelle verglich und herausfand, dass die Brustkrebszellen, die in die Schwanzvene injiziert wurden, und diejenigen, die nach der Injektion der Schwanzvene von der Lunge isoliert wurden, ähnliche globale Genexpressionsprofile aufwiesen. Im Gegensatz dazu war das globale Genexpressionsprofil orthotopisch injizierter Brustkrebszellen dramatisch anders als das von metastasierenden Lungenläsionen, die aus orthototisch injizierten Zellen9resultierten. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das orthotopische Modell physiologisch relevanter ist, da die metastasierenden Läsionen einem Selektionsprozess unterzogen werden, der dem mehrstufigen Prozess der Metastasierung ähnelt, wie er beim Menschen auftritt.
Diese Arbeit beschreibt ein orthotopisches Brustkrebsmodell (MDA-MB-231-Luc/GFP) bei Nacktmäusen, das in unserem Labor für bildgebende Detektionstechniken sowie die Identifizierung neuartiger Biomarker und die Entwicklung gezielter Chemotherapeutika optimiert wurde.
Für die Untersuchung von TNBC an Tieren wurden zwei murine Modelle entwickelt: die MDA-MB-231 humanen Brustadenokarzinomzellen bei immungeschwächten Mäusen (d. h. athymische Nacktmäuse, NSG-Mäuse) und die 4T1 bei immunkompetenten BALB/c-Mäusen. Beide Modelle haben ihre Vorteile. Die Wahl des Tiermodells für eine Studie hängt von den Forschungszielen ab. Beispielsweise ist das MDA-MB-231-Modell eine menschliche TNBC-Zelllinie, die in immungeschwächten Mäusen angebaut wird und immunsuppressive menschliche Brustkrebspatientinnen imitiert. Andererseits imitiert der invasive Phänotyp orthotopischer 4T1-Triple-negativer muriner Brustkrebszellen bei BALB/c-Mäusen den metastasierenden Prozess genau, wie er bei menschlichen Brustkrebspatientinnen im Stadium IV auftritt. Im Gegensatz zum intravenösen Zellinjektionsansatz wurden menschliche MDA-MB-231 Brustkrebszellen in ähnlicher Weise in das Brustfettpad11,12 im orthotopischen Brustkrebsmodell11,13injiziert. Das längere Tumorwachstum und die erworbene metastasierende Fähigkeit ist physiologisch relevanter, daher ist es kein künstliches metastasierendes Krebsmodell4,14. Ein solches spontanes Metastasierungsmodell imitiert die Entwicklung von menschlichem Brustkrebs mit Ausnahme des Initiationsstadiums. Dies ist ein entscheidendes Modell für das In-vivo-Arzneimittelscreening und die therapeutische Wirksamkeitsbewertung bei metastasierendem Brustkrebs.
Die Tumorimplantationsstelle in der Maus spielt eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung einer Mikroumgebung, die das Tumorwachstum und die Auswahl des metastasierenden Phänotyps unterstützt, ähnlich dem, der beim Menschen vorkommt. Der proximale Lymphknoten und das Vorhandensein von Fettgewebe sind die Schlüsselfaktoren, die das Fortschreiten der Erkrankung von Brustkrebs15,16beeinflussen. Bei einem menschlichen Patienten sind Lymphknoten und Fettgewebe beide schlüsselweise faktoren, die die Malignität und Inzidenz von Brustkrebs beeinflussen17,18,19. So kann die Auswahl der richtigen anatomischen Position für die Injektionsstelle die Relevanz des Tumormodells im Vergleich zur menschlichen Krankheit stark beeinflussen. Diese Studie verwendete die vierte Brustdrüse als Implantationsstelle hauptsächlich aufgrund der oben genannten Anforderungen und dass sie anatomisch zugänglicher und leichter zu manipulieren ist.
Es stehen verschiedene Methoden zur Berechnung des Tumorvolumens zur Verfügung, und ein Forscher kann wählen, wo er es für richtig hält. Der für diese Studie gewählte Algorithmus basiert auf den Ergebnissen von Faustino-Rocha et al., der verschiedene Berechnungsformeln für das Tumorvolumen verglichen und zu dem Schluss gekommen ist, dass die folgende Formel die genauesteist 20.
Basement Membranmatrix ist eine wichtige extrazelluläre Matrix, die in verschiedenen in vitro21 und in vivo22,23 Assays verwendet wird. Es gibt widersprüchliche Berichte22,24,25 über den Einfluss der Kellermembranmatrix auf Xenograft-Malignität. Es scheint nur die anfängliche Etablierung des Xenograft zu beeinflussen und hat keine weiteren Auswirkungen auf das Xenograft-Wachstum25. Für die beschriebene Xenograft-Implantation wurde die Kellermembranmatrix mit den Krebszellen gemischt, um die Viskosität der Zell-Gel-Mischlösung vor der Implantation zu erhöhen. Das Vorhandensein der Kellermembranmatrix reduziert den Verlust der Mischlösung von der Injektionsstelle und hält die Mischlösung an der Implantationsstelle, wodurch die Gleichmäßigkeit des implantierten Xenograftvolumens erhöht wird.
Die MDA-MB-231-Zelllinie ist eine bösartige verewigte menschliche Brustadenokarzinom-Zelllinie und ist aufgrund ihres dreifach negativen Status ein beliebtes Werkzeug in der Brustkrebsforschung. Der Einsatz von Dual-Reportern (Luciferase und GFP) zelliumieren, ermöglicht mehr Flexibilität bei der Handhabung der In-vivo- und Ex-vivo-Bildgebung. Es ist allgemein bekannt, dass das Biolumineszenzsignal eine höhere Empfindlichkeit, Tiefendetektion und einen überlegenen Kontrast (Signal-Rausch-Verhältnis) aufweist als GFP-Signale. Aus diesem Grund ist es eine weit verbreitete bildgebende Modalität für ganzkörperbildende Bildgebung. Leider ist die Biolumineszenzerkennung durch ein schmales Zeitfenster (15 bis 20 Min. nach der Luziferin-Injektion) begrenzt, in dem die Signalerkennung linear ist. DAS BLI-Signal nimmt schnell ab, wenn die Tiere eingeschläfert werden. Dies wird zu einem experimentellen Designproblem, wenn viele Mäuse eingeschläfert werden müssen und die Ernte mehrerer Gewebe oder Organe erforderlich ist. In diesen Studien wurde Blut durch direkte Herzpunktion geerntet, das Gehirn, primärer Tumor, Lunge und betroffener Lymphknoten wurden an 40 Mäusen untersucht. Als die Organe geerntet wurden und für die Ex-vivo-Bildgebung bereit waren, war das Biolumineszenzsignal nicht nachweisbar. Daher ist die GFP-Erkennung in diesen Situationen besser geeignet. Die Emission des GFP-Signals liegt im sichtbaren Bereich, und bei diesen Wellenlängen ist die Signalabsorption durch Blut (d.h. Hämoglobin) deutlich höher. Auch die Autofluoreszenz im sichtbaren Bereich durch NADH, Lipopigmente und Flavins führt zu einem signifikanten Hintergrund, der es schwierig macht, zwischen einem Low-Level-GFP-Signal und Autofluoreszenzhintergrund zu unterscheiden. Die Verwendung eines multispektralen Fluoreszenz-Bildgebungsansatzes anstelle der herkömmlichen Filterpaar-Bildgebung und der Verwendung von spektralen Unmixing-Algorithmen hilft dabei, echtes GFP-Signal im Interessensorgan zu identifizieren. Durch die Kombination der Stärken der Biolumineszenz-Bildgebung im Ganzkörper-In-vivo-Nachweis und der multispektralen GFP-Bildgebung in den Ex-vivo-Organ-/Gewebebewertungen können daher quantifizierbare Daten in einer großen Mäusekohorte maximiert werden.
Unabhängig davon, welcher Ansatz für eine Tierstudie gewählt wird, wird die Extraktion des gesamten Blutes vor der Organ-/Gewebeentnahme dringend empfohlen, insbesondere für Studien, die auf die metastasierende Belastung abzielen. Dieses Protokoll erkennt GFP-Signale aus den Blutproben, die von den Mäusen (Daten nicht gezeigt) im orthotopischen Brustkrebsmodell durch Echtzeit-PCR-Assays erhalten wurden. Die Minimierung des Blutvolumens in Organen/Geweben reduziert das falsch positive Signal in den Zielorganen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das orthotopische Brustkrebsmodell mit den MDA-MB-231-Luc/GFP-Zellen ein hochrelevantes Tiermodell ist, das den Zustand des menschlichen TNBC-Patienten genau nachahmt. Dieses Modell ist für die Untersuchung, Überwachung und Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit in einer Tumormikroumgebung ähnlich wie beim Menschen unerlässlich. Die Verwendung von dualen Reporterzelllinien verbessert die Praktikabilität dieses orthotopischen Brustkrebsmodells weiter.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten die Unterstützung durch das Intramural Research Program der National Institutes of Health, national Cancer Institute, Bethesda MD, Cancer and Inflammation Program und das Frederick National Laboratory – Small Animal Imaging Program, Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Maryland, USA.
Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
Primer3 | MIT | Primer Design | |
Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |