כאן נציג של השיטה הניסיונית כדי לבחון את התפקיד של פלסמידים multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה.
פלסמידים multicopy נפוצים מאוד אאוקריוטים אך תפקידם באבולוציה חיידקי נשאר ממעטים להבין. לאחרונה הראינו כי העלייה במספר עותק גנטי בכל תא שסופקו על-ידי פלסמידים multicopy עלול להאיץ את האבולוציה של גנים פלסמיד מקודד. בעבודה זו, אנו מציגים מערכת ניסויית לבחון את היכולת של פלסמידים multicopy כדי לקדם את ג’ין האבולוציה. באמצעות שיטות בביולוגיה מולקולרית פשוטה, ואנחנו נבנה מערכת מודל שבו שניתן להוסיף של גנים עמידות לאנטיביוטיקה Escherichia coli MG1655, הכרומוזום או על פלסמיד multicopy. אנו משתמשים בגישה ניסויית האבולוציה כדי להפיץ זנים שונים תחת הגדלת ריכוזים של אנטיביוטיקה, אנו מודדים את ההישרדות של אוכלוסיות חיידקים לאורך זמן. הבחירה של המולקולה לאנטיביוטיקה ואת הגן ההתנגדות היא הגן יכול להתייעץ רק התנגדות באמצעות הרכישה של מוטציות. גישה זו “הצלה אבולוציונית” מספק שיטה פשוטה כדי לבחון את הפוטנציאל של פלסמידים multicopy לקדם הרכישה של עמידות לאנטיביוטיקה. בשלב הבא של מערכת ניסויית, מאופיינים הבסיסים מולקולרית של עמידות לאנטיביוטיקה. כדי לזהות מוטציות אחראי על הרכישה של עמידות לאנטיביוטיקה אנו משתמשים עמוק רצפי DNA של דגימות המתקבל באוכלוסיות שלמות, שיבוטים. לבסוף, כדי לאשר את התפקיד של מוטציות בגן שנבחנה, אנחנו לשחזר אותם על רקע הורים ובדוק את ההתנגדות פנוטיפ של זנים וכתוצאה מכך.
עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים תהיה בעיה בריאות ור1. ברמה הבסיסית, ההתפשטות של עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים פתוגניים היא דוגמא פשוטה של אבולוציה על ידי הברירה הטבעית2,3. במילים פשוטות, השימוש באנטיביוטיקה יוצר מבחר זנים עמידים. בעיה מרכזיים בביולוגיה אבולוציונית, לכן היא להבין את הגורמים המשפיעים על היכולת של אוכלוסיות חיידקים לפתח עמידות לאנטיביוטיקה. מבחר ניסויים הופיעו בתור כלי רב עוצמה כדי לחקור את הביולוגיה האבולוציונית של חיידקים, שדה זה הפיק מדהים תובנות מגוון רחב של בעיות אבולוציונית-4,–5,–6. באבולוציה ניסיוני, אוכלוסיות חיידקים יזומות של זן הורים יחיד באופן סדרתי passaged בתנאים מגבילים והמוגדרים. חלק מוטציות להתרחש במהלך הצמיחה של תרבויות אלה להגדיל את כושר חיידקי, אלה מופצים דרך התרבויות על ידי הברירה הטבעית. במהלך הניסוי, דגימות של האוכלוסיות נשמרים מעת לעת cryogenically כדי ליצור שאינם הולכים ומתפתחים קפוא מאובנים רשומה. מספר רחב של גישות יכול לשמש כדי לאפיין המתפתחת אוכלוסיות חיידקים, אבל שתי השיטות הנפוצות ביותר הם מבחני כושר, המודדים את היכולת של החיידקים מפותחת כדי להתחרות נגד אבות מרוחק, רצף הגנום כולו, זה המשמש לזיהוי לשינויים גנטיים הסתגלות כונן זה. בעקבות עבודתו החלוצית על ידי ריצ’ארד לנסקי עמיתים7,8, כבר הגישה סטנדרטי באבולוציה ניסיוני לאתגר מספר קטן יחסית של אוכלוסיות שכפל (בדרך כלל < 10) עם הסתגלות חדשה אתגר סביבתי, כגון מקורות פחמן חדשים, טמפרטורה או של phage דורסנית.
זיהומים הנגרמים על ידי חיידקים עמידים בפני אנטיביוטיקה הופכים בעיה גדולה ההתנגדות היא גבוהה מספיק שזה לא אפשרי להגדיל בריכוזים אנטיביוטי לרמות קטלני ברקמות החולה. קלינאים מעוניינים ולכן מה מאפשר לחיידקים לפתח עמידות מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה כי הם מעל סף הריכוז לאנטיביוטיקה, העצירה קליניים. איך ללמוד זאת השפעול? אם מספר קטן של אוכלוסיות חיידקים מאותגרים עם מינון גבוה של אנטיביוטיקה, כמו לנסקי-סגנון ניסוי, ואז התוצאה הסבירה ביותר היא כי האנטיביוטיקה לנהוג כל האוכלוסיות הכחדה. במקביל, אם המנה של אנטיביוטיקה המשמשת נמוכה, להלן ריכוז מעכבות מינימלי (MIC) של המתח הורים, אז זה לא סביר כי אוכלוסיות חיידקים תתפתח רמות הרלוונטית קלינית של התנגדות, במיוחד אם ההתנגדות נושא עלות גדולה. אחד פשרה בין שני תרחישים אלה היא להשתמש10,119,ניסוי “הצלה אבולוציונית”. בגישה זו, מספר גדול מאוד של תרבויות (בדרך כלל > 40) נאלץ להתמודד עם מנות של אנטיביוטיקה להגדיל לאורך זמן, בדרך כלל על-ידי הכפלת ריכוז אנטיביוטיקה כל יום12. סימן ההיכר של הניסוי הזה היא כי כל התושבים לא להתפתח עמידות מוגברת תהיה מונעת הכחדה. רוב אוכלוסיות מאותגרים בדרך זו תהיה מונעת שנכחדו, אך מיעוט קטן יישמר על ידי מתפתח ברמות גבוהות של התנגדות. בנייר זה, אנו מראים איך עיצוב ניסיוני זה יכול לשמש כדי לחקור את תרומתו פלסמיד multicopy האבולוציה של עמידות.
חיידקים לרכוש עמידות לאנטיביוטיקה דרך שני מסלולים עיקריים, מוטציות כרומוזומליות, רכישת ניידת מרכיבים גנטיים, בעיקר פלסמידים13. פלסמידים לשחק תפקיד מפתח האבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה, כי הם מסוגלים להעביר גנים עמידות בין חיידקים על ידי ההטיה14,15. פלסמידים ניתן לחלק לשתי קבוצות על פי גודל וביולוגיה שלהם: “קטן”, עם העתק גבוהה מספר לכל תא החיידק, “גדול”, עם נמוך להעתיק16,מספר17. התפקיד של פלסמידים גדול באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה תועד בהרחבה כי הם כוללים פלסמידים conjugative, אשר הם מניעי מפתח של הפצת ההתנגדות עמידות רב בקרב חיידקים15. פלסמידים multicopy קטנים גם הם נפוצים מאוד חיידקים17,18, הם לעיתים קרובות קוד עבור גנים עמידות לאנטיביוטיקה19. עם זאת, תפקידו של פלסמידים multicopy קטן של התפתחות של עמידות לאנטיביוטיקה נחקרה פחותה.
עבודה אחרונים, אנחנו הציע כי פלסמידים multicopy עלול להאיץ את האבולוציה של הגנים שהם נושאים על ידי הגדלת גנים מוטציה המחירים עקב מספר עותק גנטי גבוה יותר לכל תא12. באמצעות מדגם ניסיוני עם זן e. coli MG1655 הגן β לקטמאז בלהTEM-1 זה הוצג כי פלסמידים multicopy האצת הקצב של הופעת מוטציות TEM-1 היוועצות התנגדות הדור השלישי צפלוספורין ceftazidime. תוצאות אלו ציינו כי פלסמידים multicopy עשוי לשחק תפקיד חשוב באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה.
כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של השיטה פיתחנו לחקור את multicopy בתיווך פלסמיד האבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה. בשיטה זו יש שלושה שלבים שונים: הראשון, החדרת הגן שנבחנה על פלסמיד multicopy או הכרומוזום של החיידק המארח. שנית, שימוש ניסיוני האבולוציה (הצלה אבולוציונית) כדי להעריך את הפוטנציאל של זנים שונים כדי להתאים הלחץ הסלקטיבי. והשלישי, קביעת הבסיס המולקולרי שבבסיס בתיווך פלסמיד האבולוציה באמצעות DNA רצף, שיחזור של מוטציות חשד בנפרד גנוטיפ ההורים.
בסופו של דבר, למרות הפרוטוקול המתואר כאן תוכננה לחקור את התפתחות עמידות לאנטיביוטיקה, אפשר להתווכח כי שיטה זו יכול להיות שימושי בדרך כלל לנתח את האבולוציה של חידושים נרכשה על ידי מוטציות בכל multicopy פלסמיד מקודד ג’ין.
אנו מציגים פרוטוקול חדש המשלב ביולוגיה מולקולרית, האבולוציה ניסיוני and רצפי DNA עמוק שנועד לחקור את התפקיד של פלסמידים multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. למרות פרוטוקול זה משלב טכניקות מתחומים שונים, כל השיטות נדרש לפתח אותו פשוטים, ניתן לבצע במעבדה למיקרוביולוגיה רגיל. השלב?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי דה אינסטיטוטו סאלוד Carlos III (תוכנית Estatal דה אני + D + אני 2013-2016): מעניק CP15-00012 PI16-00860, CIBER (CB06/02/0053), שיתוף מימנה הקרן אזורי אירופה פיתוח ‘ דרך להשיג אירופה”(ERDF). ג’אי נתמך על-ידי התוכנית Atracción דה talento של ממשלת האזור של מדריד (2016-T1/ביו-1105) ואני + D Excelencia של הספרדים Ministerio דה Economía, תעשייה y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM נתמך על-ידי מלגת Servet מיגל דה אינסטיטוטו סאלוד Carlos III (MS15/00012) שיתוף הממומן על ידי הקרן החברתית האירופאית “השקעה בעתיד שלך” (ESF) ו ERDF.
Thermocycler | BioRad | C1000 | |
Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
Incubator | Memmert | UF1060 | |
Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
96-well plates | Falcon | 351172 | |
LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |