Prova il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli Antibiotico

Resistenza agli antibiotici nei batteri è un problema di salute importante¹. A un livello fondamentale, la diffusione della resistenza agli antibiotico nei batteri patogeni è un semplice esempio dell’evoluzione attraverso la selezione naturale^2,3. In parole povere, l’uso di antibiotici genera la selezione di ceppi resistenti. Un problema chiave nella biologia evolutiva, pertanto, è di comprendere i fattori che influenzano la capacità delle popolazioni batteriche di evolvere la resistenza agli antibiotici. Esperimenti di selezione sono emerse come uno strumento molto potente per studiare la biologia evolutiva dei batteri, e questo campo ha prodotto incredibili intuizioni in una vasta gamma di problemi evolutivi^4,5,6. In evoluzione sperimentale, popolazioni batteriche avviate da un unico ceppo parentale in serie sono attraversate in condizioni definite e strettamente controllate. Alcune delle mutazioni che si verificano durante la crescita di queste culture aumentare la forma fisica batterica, e questi diffondere attraverso le culture tramite la selezione naturale. Durante l’esperimento, campioni delle popolazioni sono periodicamente criogenicamente conservati per creare un record di fossili congelato non in evoluzione. Un ampio numero di approcci può essere utilizzato per caratterizzare in evoluzione di popolazioni batteriche, ma i due metodi più comuni sono saggi di fitness, che misura la capacità dei batteri evoluti per competere contro i loro lontani antenati e sequenziamento del genoma intero, che è utilizzato per identificare i cambiamenti genetici che l’adattamento in auto. A seguito di lavoro pionieristico di Richard Lenski e colleghi^7,8, l’approccio standard in evoluzione sperimentale è stato quello di sfidare un numero relativamente piccolo di popolazioni replicare (in genere < 10) con adattamento a un nuovo sfida ambientale, come ad esempio nuove fonti di carbonio, la temperatura o un fago predatorio.

Infezioni causate da batteri resistenti agli antibiotici diventano un grosso problema quando la resistenza è abbastanza alta che non è possibile aumentare le concentrazioni di antibiotiche a livelli letali nei tessuti del paziente. I clinici sono quindi interessati a ciò che permette ai batteri di evolvere la resistenza ad alte dosi di antibiotico che si trovano sopra questa concentrazione di antibiotico di soglia, il punto di interruzione clinica. Come studiare sperimentalmente questo? Se un piccolo numero di popolazioni batteriche è sfidato con un’alta dose di antibiotico, come in uno stile di Lenski esperimento, quindi il risultato più probabile è che l’antibiotico guiderà tutte le popolazioni all’estinzione. Allo stesso tempo, se la dose di antibiotico utilizzato è bassa, sotto la concentrazione inibitoria minima (MIC) del ceppo parentale, allora è improbabile che popolazioni batteriche si evolveranno clinicamente rilevanti livelli di resistenza, soprattutto se resistenza comporta un costo grande. Un compromesso tra questi due scenari consiste nell’utilizzare un “salvataggio evolutivo” esperimento^9,10,11. In questo approccio, un numero molto elevato di culture (in genere > 40) è contestato con dosi di antibiotici che aumentano nel tempo, in genere raddoppiando la concentrazione di antibiotica ogni giorno¹². Il segno distintivo di questo esperimento è che qualsiasi popolazione che non si evolve la resistenza aumentata sarà guidato all’estinzione. La maggior parte delle popolazioni che si sono sfidate in questo modo saranno guidate estinte, ma una piccola minoranza persisterà evolvendosi elevati livelli di resistenza. In questa carta, indichiamo come questo disegno sperimentale può essere utilizzato per studiare multicopia plasmide contributo all’evoluzione della resistenza.

I batteri acquisire resistenza agli antibiotici attraverso due itinerari principali, le mutazioni cromosomiche e l’acquisizione di elementi genetici mobili, per lo più plasmidi¹³. Plasmidi gioca un ruolo chiave nell’evoluzione della resistenza agli Antibiotico, perché essi sono in grado di trasferire geni di resistenza tra i batteri da coniugazione^14,15. Plasmidi possono essere divisi in due gruppi secondo la loro dimensione e biologia: “più piccoli”, con numero di alta copia per cellula batterica e “grandi”, con bassa copiare numero^16,17. Il ruolo dei plasmidi grande nell’evoluzione della resistenza agli antibiotico è stata ampiamente documentato perché essi comprendono plasmidi coniugativi, che sono fattori chiave della diffusione di resistenza e resistenza multi tra batteri¹⁵. Piccoli plasmidi multicopia anche sono estremamente comuni in batteri^17,18, ed essi spesso codice per geni di resistenza agli antibiotici¹⁹. Tuttavia, il ruolo dei piccoli plasmidi multicopia nell’evoluzione della resistenza agli antibiotico è stato studiato in misura minore.

In un recente lavoro, abbiamo proposto che plasmidi multicopia potrebbero accelerare l’evoluzione dei geni che portano aumentando i tassi di mutazione genica dovuta al maggior numero di copia del gene per cellula¹². Utilizzando un modello sperimentale con Escherichia coli ceppo MG1655 e il β-lactamase gene bla_TEM-1 è stato indicato che plasmidi multicopia accelerato il tasso di comparsa di TEM-1 mutazioni che conferiscono resistenza alla terza generazione ceftazidime cefalosporina. Questi risultati hanno indicato che i plasmidi multicopia potrebbero svolgere un ruolo importante nell’evoluzione della resistenza agli antibiotico.

Qui, presentiamo una descrizione dettagliata del metodo abbiamo sviluppato per studiare l’evoluzione multicopia plasmide-mediata della resistenza agli antibiotico. Questo metodo ha tre diverse fasi: primo, inserimento del gene in esame in un plasmide multicopia o il cromosoma del batterio ospite. In secondo luogo, utilizzare dell’evoluzione sperimentale (salvataggio evolutiva) per valutare il potenziale dei diversi ceppi di adattarsi alla pressione selettiva. E terzo, determinare la base molecolare sottostante plasmide-mediata evoluzione usando il DNA sequencing e ricostruendo le mutazioni sospetta individualmente nel genotipo parentale.

Infine, anche se il protocollo descritto qui è stato destinato per studiare l’evoluzione della resistenza agli Antibiotico, si può sostenere che questo metodo potrebbe essere generalmente utile per analizzare l’evoluzione delle innovazioni acquisite dalle mutazioni in qualsiasi multicopia gene di plasmide-codificati.