Testen die Rolle des Multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen

Antibiotika-Resistenz bei Bakterien ist ein großes gesundheitliches Problem¹. Auf einer grundlegenden Ebene ist die Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen bei pathogenen Bakterien ein einfaches Beispiel der Evolution durch natürliche Selektion^2,3. Einfach ausgedrückt, generiert die Anwendung von Antibiotika Auswahl für resistente Stämme. Ein zentrales Problem in der Evolutionsbiologie, deshalb, um die Faktoren zu verstehen, die Einfluss auf die Fähigkeit der Bakterienpopulationen zu Resistenzen gegen Antibiotika entwickeln. Auswahl Experimente entstanden als ein sehr mächtiges Werkzeug um die Evolutionsbiologie von Bakterien zu untersuchen hat, und dieses Feld unglaubliche Einblicke in eine Vielzahl von evolutionären Probleme^4,5,6. In experimentelle Evolution sind seriell Bakterienpopulationen initiiert von einem einzigen elterlichen Belastung unter definierten und streng kontrollierten Bedingungen passagiert. Einige Mutationen, die während des Wachstums dieser Kulturen auftreten bakterieller Fitness steigern und diese zu verbreiten durch die Kulturen durch natürliche Selektion. Während des Experiments sind Proben der Bevölkerungen in regelmäßigen Abständen tiefkalt beibehalten, um nicht weiterentwickelnden gefrorenen fossilen aufzuzeichnen. Eine Vielzahl von Ansätzen lässt sich entwickelnden Bakterienpopulationen zu charakterisieren, aber die zwei am häufigsten verwendeten Methoden sind Fitness-Assays, die messen die Fähigkeit der weiterentwickelten Bakterien konkurrieren gegen ihre Vorfahren und kompletten Genoms, das ist verwendet, um den genetischen Veränderungen, dass Laufwerk Anpassung identifizieren. Nach Pionierarbeit von Richard Lenski und Kollegen^7,8, der Standardansatz in experimentelle Evolution wurde gegen eine relativ kleine Anzahl von replizieren Bevölkerungen (in der Regel < 10) mit der Anpassung an eine neue umweltpolitische Herausforderung, wie neue Kohlenstoffquellen, Temperatur oder eine räuberische Phagen.

Infektionen durch Antibiotika-resistente Bakterien werden ein großes Problem, wenn Widerstand hoch genug ist, dass es nicht möglich, Antibiotika-Konzentrationen zu tödlichen Niveaus in Patienten Gewebe zu erhöhen. Ärzte sind daher interessiert was ermöglicht Bakterien Resistenz gegen hohe Dosen von Antibiotika zu entwickeln, die über diese Antibiotika Grenzkonzentration, der klinischen Haltepunkt liegen. Wie um dies experimentell zu studieren? Wenn eine kleine Anzahl von Bakterienpopulationen mit einer hohen Dosis des Antibiotikums herausgefordert werden, wie in einem Lenski-Stil Experiment, dann das wahrscheinlichste Ergebnis ist, dass das Antibiotikum alle Bevölkerungen zum Aussterben führen wird. Zur gleichen Zeit wenn die Dosis des Antibiotikums, die verwendet wird niedrig, unterhalb der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) des elterlichen Stammes ist ist dann es unwahrscheinlich, dass sich die Bakterienpopulationen klinisch relevante Ebenen des Widerstandes, vor allem, wenn Widerstand trägt eine große Kosten. Ein Kompromiss zwischen diesen beiden Szenarien ist eine “evolutionäre Rettung” Experiment^9,10,11zu verwenden. Dieser Ansatz bietet eine sehr große Anzahl von Kulturen (in der Regel > 40) ist mit Dosen von Antibiotika, die im Laufe der Zeit in der Regel erhöhen durch eine Verdoppelung der Antibiotika Konzentration jeden Tag¹²gefordert. Das Markenzeichen dieses Experiments ist, dass eine Bevölkerung, die nicht erhöhten Resistenz entwickelt zum Aussterben getrieben wird. Die meisten Populationen, die auf diese Weise in Frage gestellt werden werden ausgestorben getrieben, aber eine kleine Minderheit bleibt bestehen, durch die sich verändernden hohes Maß an Widerstand. In diesem Beitrag zeigen wir Verwendung von dieser Versuchsanordnung multicopy Plasmid Beitrag zur Evolution des Widerstands zu untersuchen.

Bakterien resistent gegen Antibiotika durch zwei Hauptrouten, chromosomalen Mutationen und Akquisition von mobile genetische Elemente, vor allem Plasmide¹³. Plasmide spielen eine Schlüsselrolle in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen, weil sie sich Resistenzgene zwischen Bakterien durch Konjugation^14,15übertragen können. Plasmide können in zwei Gruppen entsprechend ihrer Größe und Biologie unterteilt werden: “klein”, mit hohen Kopienzahl pro Bakterienzelle und “large”, mit niedrigen kopieren Nummer^16,17. Die Rolle der großen Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen ist ausführlich dokumentiert worden, weil sie konjugative Plasmide enthalten die wichtigsten Triebkräfte für die Verbreitung der Resistenz und Multi-Resistenz Bakterien¹⁵sind. Kleinen multicopy Plasmide sind ebenfalls sehr häufig in Bakterien^17,18, und sie oft code für Antibiotika-Resistenz-Gene-¹⁹. Allerdings ist die Rolle des kleinen multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen in geringerem Umfang untersucht worden.

In einer neueren Arbeit haben wir vorgeschlagen, multicopy Plasmide die Entwicklung der Gene tragen sie durch die Erhöhung gen Mutationsraten aufgrund der höheren gen Kopienzahl pro Zelle¹²beschleunigen könnte. Mit einem experimentellen Modell mit E. Coli -Stamm MG1655 und β-Lactamase-gen Bla_TEM-1 zeigte sich, dass multicopy Plasmide beschleunigt die Rate des Auftretens von TEM-1 Mutationen verleihen Resistenz gegen die dritte generation Cephalosporin Ceftazidim. Diese Ergebnisse zeigten, dass multicopy Plasmide eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen spielen könnte.

Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung der Methode wir entwickelt haben, um die multicopy Plasmid-vermittelten Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen zu untersuchen. Diese Methode hat drei Stufen: Erstens Einfügen des Gens untersuchten in einem multicopy Plasmid oder das Chromosom des Bakteriums Host. Zweitens der experimentelle Evolution (evolutionäre Rettung) verwenden Sie, um das Potenzial der verschiedenen Stämme zur Anpassung an den Selektionsdruck zu beurteilen. Und drittens, Bestimmung der molekularen Grundlagen Plasmid-vermittelten Evolution mit der DNA Sequenzierung und die Rekonstruktion der vermuteten Mutationen einzeln in das elterliche Erbgut zugrunde.

Schließlich, obwohl das hier beschriebene Protokoll entwickelt wurde, um die Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen zu untersuchen, kann man argumentieren, dass diese Methode in der Regel sinnvoll, die Entwicklung von Innovationen, die durch Mutationen in jedem Multicopy erworben zu analysieren sein könnte Plasmid-kodierte gen.