Analyse le rôle des plasmides multi-copies dans l’évolution de la résistance aux antibiotique

La résistance aux antibiotique chez les bactéries est un problème majeur de santé¹. À un niveau fondamental, la propagation de la résistance aux antibiotique chez les bactéries pathogènes est un exemple simple de l’évolution par sélection naturelle^2,3. Autrement dit, l’utilisation d’antibiotiques génère de sélection de souches résistantes. Un problème majeur en biologie de l’évolution, est donc de comprendre les facteurs qui influencent la capacité des populations bactériennes à évoluer de la résistance aux antibiotiques. Expériences de sélection ont émergé comme un outil très puissant pour étudier la biologie de l’évolution des bactéries, et ce domaine a produit un aperçu incroyable un large éventail de problèmes évolutifs^4,5,6. En évolution expérimentale, les populations bactériennes effectuées à partir d’une seule souche parentale sont en série repiquées dans des conditions définies et étroitement contrôlées. Certaines mutations qui se produisent au cours de la croissance de ces cultures augmentent bactérienne remise en forme, et ceux-ci se propager à travers les cultures par la sélection naturelle. Pendant l’expérience, les échantillons des populations sont conservés périodiquement cryogénie pour créer un enregistrement fossile congelé non en évolution. Un grand nombre d’approches peut être utilisé pour caractériser l’évolution des populations bactériennes, mais les deux méthodes les plus courantes sont les essais de remise en forme, qui mesurent la capacité des bactéries évolués de rivaliser contre leurs lointains ancêtres et le séquençage du génome entier, qui est permet d’identifier les changements génétiques que l’adaptation en voiture. Après les travaux pionniers de Richard Lenski et collègues^7,8, l’approche standard en évolution expérimentale a été de contester un nombre relativement faible des populations répétées (typiquement < 10) à s’adapter à un nouveau défi environnemental, telles que de nouvelles sources de carbone, la température ou un phage prédatrice.

Les infections causées par des bactéries résistantes aux antibiotiques deviennent un gros problème quand la résistance est suffisamment élevée pour qu’il n’est pas possible d’augmenter les concentrations d’antibiotique à des niveaux mortels dans les tissus du patient. Les cliniciens sont donc intéressés par ce qui permet aux bactéries d’évoluer résistance à de fortes doses d’antibiotiques qui sont au-dessus de ce seuil de concentration antibiotique, le point d’arrêt clinique. Comment étudier ceci expérimentalement ? Si un petit nombre de populations bactériennes est mis au défi avec une forte dose d’antibiotique, comme dans un style Lenski experiment, alors le résultat le plus probable est que l’antibiotique conduira toutes les populations à l’extinction. Dans le même temps, si la dose d’antibiotique qui est utilisé est basse, inférieure à la concentration minimale inhibitrice (CMI) de la souche parentale, puis il est peu probable que les populations bactériennes évoluera cliniquement pertinents niveaux de résistance, surtout si résistance entraînera un coût important. Un compromis entre ces deux scénarios consiste à utiliser un « sauvetage évolutive » expérience^9,10,11. Dans cette approche, un très grand nombre de cultures (typiquement > 40) doit relever le défi avec des doses d’antibiotiques qui augmentent au fil du temps, généralement en doublant la concentration d’antibiotique chaque jour¹². La principale caractéristique de cette expérience est que toute la population qui n’évolue pas de résistance accrue est conduite à l’extinction. La plupart des populations qui sont mis au défi de cette manière seront pilotées disparues, mais une petite minorité sera présent en évoluant à des niveaux élevés de résistance. Dans cet article, nous montrons comment cette conception expérimentale peut être utilisée pour étudier la contribution de plasmide Multicopie à l’évolution de la résistance.

Les bactéries acquièrent la résistance aux antibiotiques par le biais de deux voies principales, mutations chromosomiques et d’acquisition d’éléments génétiques mobiles, pour la plupart des plasmides¹³. Plasmides jouent un rôle clé dans l’évolution de la résistance aux antibiotique, parce qu’ils sont en mesure de transférer des gènes de résistance entre bactéries par conjugaison^14,15. Plasmides peuvent être divisés en deux groupes selon leur taille et de la biologie : « petit », avec le nombre élevé de copies par cellule bactérienne et les « grands », avec faible copie numéro^16,17. Le rôle des grands plasmides dans l’évolution de la résistance aux antibiotique a été largement documenté parce qu’elles incluent les plasmides conjugatifs, qui sont les principaux moteurs de la diffusion de la résistance et la résistance chez les bactéries¹⁵multi. Petits plasmides multi-copies sont également extrêmement fréquents chez les bactéries^17,18, et ils codent souvent pour de gènes de résistance aux antibiotiques¹⁹. Cependant, le rôle des petits plasmides multi-copies dans l’évolution de la résistance aux antibiotique a été étudié dans une moindre mesure.

Dans un ouvrage récent, nous avons proposé que les plasmides multi-copies pourraient accélérer l’évolution des gènes qu’ils transportent en augmentant le taux de mutation de gène en raison du nombre de copie de gène supérieur par cellule¹². En utilisant un modèle expérimental avec la souche e. coli MG1655 et la β-lactamase gène bla_TEM-1 , il a été démontré que les plasmides multi-copies accélèrent le taux d’apparition de TEM-1 mutations conférant la résistance à la troisième génération céphalosporines ceftazidime. Ces résultats indiquent que les plasmides multi-copies pourraient jouer un rôle important dans l’évolution de la résistance aux antibiotique.

Nous présentons ici une description détaillée de la méthode que nous avons mis au point pour analyser l’évolution de la médiation plasmidique multicopie de résistance aux antibiotique. Cette méthode a trois différentes étapes : tout d’abord, insertion du gène à l’étude dans un plasmide Multicopie ou le chromosome de la bactérie hôte. En second lieu, utiliser des évolution expérimentale (sauvetage évolutive) pour évaluer le potentiel des souches différentes pour s’adapter à la pression de sélection. Et Troisièmement, déterminer les bases moléculaires qui sous-tendent la médiation plasmidique evolution en utilisant l’ADN, séquençage et la reconstruction de ces mutations présumées individuellement dans le génotype parental.

Enfin, bien que le protocole décrit ici a été conçu pour analyser l’évolution de la résistance aux antibiotique, on peut affirmer que cette méthode pourrait être généralement utile pour analyser l’évolution des innovations acquis par des mutations dans n’importe quel multicopies gène plasmidique codée.