本协议描述了一种用于研究术后 neuroinflammation 和行为变化机制的骨科手术小鼠模型, 并结合联体共生, 研究了衰老过程中的组织再生。
手术通常用于改善和维持生活质量。不幸的是, 在诸如老年人等易受伤害的患者中, 可能会出现并发症, 并显著降低结果。事实上, 经过例行矫形外科手术来修复骨折, 多达50% 的老年患者患有谵妄等神经系统并发症。此外, 手术后愈合和再生组织的能力随着年龄的增加而减少, 并可能影响骨折修复的质量, 甚至是骨整合的植入物。因此, 更好地了解推动这些年龄依赖性变化的机制可以提供战略目标, 以尽量减少这种并发症的风险并优化结果。在这里, 我们介绍了一个临床相关的小鼠胫骨骨折模型。这些小鼠的术后变化模仿了人类常规骨科手术后常见的认知障碍。简单地, 在严格无菌条件下, 右后肢进行切口。肌肉是分离的, 一个0.38 毫米不锈钢针插入到胫骨上端, 髓内管内。然后进行截骨术, 并缝合伤口。我们使用这个模型来研究手术创伤对术后 neuroinflammation 和行为改变的影响。应用该骨折模型结合联体共生, 建立了2只小鼠吻合的手术模型, 研究了系统恢复器官功能和损伤后组织再生的细胞和分泌因子。通过遵循我们的循序渐进的协议, 这些模型可以复制高保真度, 并可以适应审问许多生物通路, 被手术创伤改变。
手术改变了医疗保健系统, 并不断促进尖端技术, 改善安全, 并保持生活质量。不幸的是, 手术还诱发病理生理反应, 可能导致术后并发症, 包括伤口感染, 神经损伤, 甚至死亡率, 特别是在老年患者1,2。骨科手术是例行的, 特别是在老年人, 以改善生活质量和修复常见的骨骼损伤。然而, 多达50% 的骨科手术患者谁是65岁以上的经历神经损伤, 如术后谵妄。这与预后不佳有关,即, 5 倍增加6月死亡率的风险, 持续功能下降, 每位病人的护理时间增加, 住院期限延长, 以及护理家庭安置率较高3,4,5. 已经确定了一些危险因素, 包括晚期年龄, 但对于手术后神经系统损伤的机制知之甚少。
由于骨折在老年人中很常见, 我们建立了一个小鼠胫骨骨折模型, 以确定周围创伤对术后恢复的影响, 包括 neuroinflammation 和脑健康 (认知功能)6,7. 此模型最初由哈利et . 描述。8, 由髓内钉和胫骨骨折在全身麻醉和镇痛, 从而模仿皮肤损伤, 肌肉创伤, 骨修复相关的常见长骨骨折和修复的人。在这个过程之后, 老鼠演示炎症标记物的变化类似于人类观察到的变化9,10, 以及胶质激活在海马, 这是与赤字的声明性记忆和海马可塑性6,7,11。我们以前把这个断裂模型和联体共生结合在一起。联体共生是一种外科模型, 其中2只小鼠吻合, 从而共享循环系统。该模型为了解循环细胞和体液因子对器官功能的调节作用在年龄和疾病的背景下, 提供了突破12,13,14。使用这种方法, 我们最近发现了与年龄相关的骨折愈合相关的系统性因素12。
在这里, 我们引入了一个协议, 结合胫骨骨折模型与联体共生研究骨对脑年龄依赖性机制, 这是有关的再生医学和神经免疫学。协议1A 描述了联体共生过程, 协议1B 详细说明了胫骨骨折过程 (图1A)。根据审讯的性质, 可以独立或组合执行这些操作。
骨折是常见的临床问题, 仍然是发病率的主要原因, 特别是在快速增长的老年人群中。在这里, 我们引入了一步一步的协议, 一个小鼠胫骨骨折模型的研究机制负责术后 neuroinflammation 和认知障碍。该模型可与联体共生手术结合, 研究神经免疫相互作用, 组织再生和其他信号过程。了解这些机制将提供战略目标, 以尽量减少术后并发症的风险和优化结果。
为研究啮齿目动物的骨修复, 开发了几种矫形模型25。我们采用和修改了这个胫骨骨折的程序, 最初描述哈利et 等。8, 研究骨科手术对脑功能的影响。我们还使用这个骨折模型结合我们的联体共生模型, 以调查的因素, 负责骨愈合和年龄依赖性的组织再生。当在不稳定的全麻下进行时, 这种胫骨骨折程序只需要大约15分钟的每只动物, 结果为零到最低死亡率 (取决于老鼠的年龄和潜在的遗传敏感性), 和概括共同与长骨骨折和骨科手术创伤有关的侮辱。因此, 该模型是最理想的审讯生物通路和执行纵向评估。然而, 重要的是, 截骨和固定是可重复的, 对软组织的损害是一致的。软组织损伤可以调制, 例如通过剥离骨膜和捏周围的肌肉, 使手术更具创伤性。外伤性骨折不固定钝伤或三点弯曲的模型不能提供这样的一致性或准确性。这些程序往往导致再次伤害, 导致长期炎症反应。相反, 涉及刚性固定的骨折模型有一个更温和的炎症, 不完全重述与骨科手术有关的损害26,27。
其他使用钛合金钉扎的模型也被开发来密切模仿人的人工关节成形术, 可能更适合于在小鼠中审问假体不稳定性、骨溶解和假体相关并发症28,29.钻孔模型, 如这里提出的, 提供足够的稳定, 和小鼠可以测试的行为范式没有严重的赤字, 可能会混淆这样的任务, 如恐惧调理或开放领域运动/焦虑测试6 ,7,11,15,19,20。但是, 如果固定不正确锁定, 则会发生旋转畸形。一些模型使用外固定器, 它提供了优越的稳定性, 但在小鼠胫骨中实现是挑战, 虽然它可以成功地实现在鼠标股骨27。
包括谵妄和术后认知功能障碍在内的认知障碍是骨科骨折修复术后常见的并发症, 特别是在老年和虚弱患者中,30。本临床相关的小鼠胫骨骨折手术模型表明, 术后系统性细胞因子释放6,7,17, 受损血脑屏障功能15,19和改变的胶质形态学16,22, 导致记忆障碍, 并可能代表手术后许多患者术后神经系统并发症的关键特征。值得注意的是, 其他手术方法已被用于模型的术后认知功能障碍的小鼠。这些包括腹部31,32,33和血管34手术, 以及肤浅的创伤35,36。联体共生技术适用于所有这些模型, 它们共享类似的端点, 包括炎症、胶质活化和行为缺陷, 这可能由共同的机制介导。
包括联体共生在内的研究揭示了影响衰老动物认知功能、neuroinflammation 和组织复兴的循环因素的新作用 37, 38, 39, 40 ,41,42。我们已经表明, 联体共生可以成功地结合在这里描述的胫骨骨折模型, 以审问再生通路和研究机制涉及血液传播因素, 影响愈合和骨折修复 12.在这里, 我们证明, 当年老的动物与幼兽吻合时, 衰老动物的骨折修复能力是可以恢复的。这种年龄逆转的根源在于骨折部位造血细胞的植入。有趣的是, 通过将幼骨髓移植到老龄小鼠身上, 也可以实现这种复兴。在这方面, 骨髓移植可以被认为是一种更直接和更简单的替代方法联体共生。然而, 联体共生是一种比较健壮的模型, 用于研究循环细胞和因子的功能。我们预计, 结合联体共生和骨科手术模型将发挥重要作用, 回答关键问题的围手术期护理和老化生物学。
总之, 我们介绍了一步一步的协议, 为一个小鼠胫骨骨折模型的研究机制负责的手术后 neuroinflammation 和认知障碍的矫形外科手术程序。该模型可与联体共生程序结合, 研究神经免疫相互作用, 组织再生和其他途径。定义这些机制将提供战略目标, 以尽量减少术后并发症的风险和优化结果。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢凯西量具, BS (麻醉学系, 杜克大学医学中心, 达勒姆, NC) 的编辑协助。NT 承认来自杜克麻醉学和 NIH/NIA R01 AG057525-01 的梦想创新补助金的支持。
Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used |
Buprenorphine | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496- 6757-1 | Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | 70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning |
10% povidone Iodine | Dynarex | For antiseptic treatment of skin | |
SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | Low Flow Anesthesia system |
MouseSTAT | Kent Scientific | PS1161 | Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor |
Shaver | Wahl | 9854L | |
Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
Scalpel Handle | Fine science tools | 10003-12 | |
Scalpel Blades – #11 | Fine science tools | 10011-00 | |
Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | Needed for stripping the periosteum |
Iris Forceps | Fine science tools | 11066-07 | Useful (1×2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma |
Bonn Scissors (Straight) | Fine science tools | 14084-08 | Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt |
Fine Scissors | Fine science tools | 14058-09 | Sharp scissors for cutting sutures |
22G x 3.5 In Quincke Spinal Needle | BD | 405181 | Use inner rod for pinning |
Needle Holders | Fine science tools | 12001-13 | |
Suture | Look | 1079B | |
C57BL6/J | Jackson Laboratory | stock no. 000664 | |
eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously) | Jackson Laboratory | stock no. 003291 |