Este protocolo describe un modelo de ratón de cirugía ortopédica que se ha utilizado para estudiar mecanismos de neuroinflamación postoperatoria y cambios de comportamiento y cuando se combina con la parabiosis, para estudiar la regeneración de los tejidos durante el envejecimiento.
Cirugía se utiliza comúnmente para mejorar y mantener la calidad de vida. Por desgracia, en pacientes vulnerables como los ancianos, las complicaciones pueden ocurrir y disminuir significativamente el resultado. De hecho, después de la cirugía ortopédica rutinaria para reparar una fractura, tanto como el 50% de los pacientes ancianos padecen complicaciones neurológicas como delirio. Además, la capacidad de sanar y regenerar el tejido después de la cirugía disminuye con la edad y puede afectar la calidad de la reparación de la fractura e incluso óseo integración de implantes. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos que impulsan estos cambios depende de la edad podría proporcionar objetivos estratégicos para minimizar el riesgo de estas complicaciones y optimizar los resultados. Aquí, presentamos un modelo de ratón clínicamente relevantes de fractura tibial. Los cambios postoperatorios en estos ratones imitan algunas de las debilitaciones cognoscitivas comúnmente observadas después de la cirugía ortopédica rutinaria en los seres humanos. Brevemente, se realiza una incisión en la extremidades derecha bajo condiciones estrictamente asépticas. Los músculos se desvincularon y un pasador de 0.38 mm de acero inoxidable se inserta en la cresta superior de la tibia, en el canal intramedular. La osteotomía se realiza, y la herida es con grapas. Hemos utilizado este modelo para investigar los efectos del trauma quirúrgico postoperatorio neuroinflamación y cambios de comportamiento. Mediante la aplicación de este modelo de fractura en combinación con la parabiosis, un modelo quirúrgico en el cual se anastomosa 2 ratones, hemos estudiado y secretadas factores que sistémicamente rejuvenecen órganos función y tejido la regeneración después de lesión. Siguiendo nuestro protocolo paso a paso, estos modelos se pueden reproducir con alta fidelidad y pueden ser adaptados a interrogar a muchas vías biológicas que son alteradas por el trauma quirúrgico.
La cirugía ha transformado el sistema de salud médico y continuamente está contribuyendo a la tecnología de punta, mayor seguridad y mantiene la calidad de vida. Desafortunadamente, la cirugía también induce respuestas fisiopatológicas que pueden conducir a complicaciones postoperatorias como infecciones de la herida, problemas neurológicos e incluso mortalidad, particularmente en pacientes mayores de1,2. Cirugía ortopédica se realiza rutinariamente, especialmente en los adultos mayores, para mejorar la calidad de vida y reparar lesiones óseas comunes. Sin embargo, hasta un 50% de los pacientes de cirugía ortopédica que son 65 años y mayor experiencia debilitaciones neurológicas como delirio postoperatorio. Esta siempre se correlaciona con mal pronóstico, es decir, 5-fold mayor riesgo de mortalidad a los 6 meses, el persistente deterioro funcional, mayor tiempo por paciente, mayor duración de la estancia hospitalaria y tasas más altas de colocación de asilos de enfermería 3 , 4 , 5. se han identificado algunos factores de riesgo, como edad avanzada, pero poco se sabe sobre los mecanismos responsables de deficiencias neurológicas después de la cirugía.
Puesto que las fracturas son muy comunes en los ancianos, hemos establecido un modelo de ratón de la fractura tibial para determinar el impacto del trauma periférico en la recuperación postoperatoria, incluyendo la neuroinflamación y cerebro salud (función cognitiva)6, 7. este modelo, descrito originalmente por Harry et al. 8, consiste en la fijación intramedular y fractura tibial bajo anestesia general y analgesia y así imita la lesión de la piel, trauma muscular, y hueso asociada con las fracturas del largo-hueso común de reparación y reparación en los seres humanos. Después de este procedimiento, ratones demuestran cambios en los marcadores inflamatorios similares a los cambios observados en los seres humanos9,10, así como la activación microglial en el hipocampo, que está asociada con déficits en la memoria declarativa y hipocampal de neuroplasticidad6,7,11. Previamente hemos combinado este modelo de fractura con parabiosis. Parabiosis es un modelo quirúrgico en el que se anastomosa 2 ratones y así compartan un sistema circulatorio. Este modelo ha proporcionado un gran avance en la comprensión de los efectos reglamentarios de circulación de las células y factores humorales en la función del órgano en el contexto de la enfermedad y la edad de13,12,14. Utilizando este enfoque recientemente hemos descubierto factores sistémicos de fractura depende de la edad curación12.
Aquí, presentamos un protocolo que combina el modelo de fractura tibial con parabiosis para estudiar mecanismos dependientes de la edad de hueso del cerebro, que son relevantes para la medicina regenerativa y Neuroinmunología. 1A protocolo describe el procedimiento de parabiosis y detalles del protocolo 1B el procedimiento de fractura tibial (figura 1A). Éstos pueden realizarse de forma independiente o en combinación, dependiendo de la naturaleza del interrogatorio.
Las fracturas son un problema clínico común y siguen siendo una causa importante de morbilidad, particularmente en la creciente población mayor. Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para un modelo de ratón de fractura tibial para estudiar mecanismos responsables postoperatorio neuroinflamación y deterioro cognitivo. Este modelo puede combinarse con cirugía de parabiosis para estudiar las interacciones neuro-inmune, regeneración de tejidos y otros procesos de señalización. Entender estos mecanismos proporcionará objetivos estratégicos para minimizar los riesgos de complicaciones postoperatorias y optimizar los resultados.
Varios modelos ortopédicos se han desarrollado para estudiar la reparación ósea en roedores25. Hemos adoptado y modificado este procedimiento de fractura tibial, descrito originalmente por Harry et al. 8para estudiar efectos de la cirugía ortopédica en función del cerebro. También hemos usado este modelo de fractura en combinación con nuestro modelo de parabiosis investigar factores que son responsables de la cicatrización ósea y regeneración de los tejidos dependientes de la edad. Cuando se realiza bajo anestesia general volátil, este procedimiento de fractura tibial requiere unos 15 minutos por animal, resultados en cero mortalidad mínima (dependiendo de la edad del ratón y susceptibilidades genéticas subyacentes) y recapitula común injurias asociadas con fractura de hueso largo y trauma quirúrgico ortopédico. Así, este modelo es ideal para interrogar a vías biológicas y realización de evaluaciones longitudinales. Sin embargo, es fundamental que la osteotomía y la fijación son reproducibles, y que daño a los tejidos blandos es consistente. Daño de tejido suave puede ser modulada, por ejemplo el periostio y pellizcando los músculos circundantes para hacer la cirugía más traumático. Modelos de fractura traumática inducida por trauma embotado no fija o tres puntos de flexión no proporcionaría tal consistencia o exactitud. Estos procedimientos a menudo resultan en nuevas lesiones, que conduce a la respuesta inflamatoria prolongada. Por el contrario, los modelos de fractura con fijación rígida tienen una inflamación más moderada, que no recapitular completamente el daño asociado con la cirugía ortopédica26,27.
Otros modelos utilizando clavos de aleación de titanio se han desarrollado cerca mímica artroplastia humana y pueden ser más relevantes para interrogar a inestabilidad de la prótesis, osteólisis y complicaciones asociadas a prótesis en ratones28,29 . Modelos de agujero de taladro como el que aquí se presenta, proporcionar estabilización adecuada y ratones pueden probarse en paradigmas conductuales sin déficits significativos que podrían confundir tareas como miedo acondicionado o abierto campo locomoción, ansiedad prueba6 ,7,11,15,19,20. Sin embargo, deformidades rotacionales pueden ocurrir si la fijación no está correctamente bloqueada. Algunos modelos usan un fijador externo, que proporciona estabilización superior pero es difícil de implementar en la tibia de un ratón, aunque puede ser aplicado con éxito en un fémur de ratón27.
Las debilitaciones cognoscitivas, incluyendo delirio y la disfunción cognitiva postoperatoria, son complicaciones frecuentes después de cirugía ortopédica para la reparación de la fractura, especialmente en pacientes de edad avanzada y frágil30. Este modelo de ratón clínicamente relevantes de la cirugía de la fractura tibial demuestra que postoperatorias sistémicas cytokine release6,7,17, deteriorada barrera blood – brain función15,19 , alterado microglial morfología16,22, contribuir a la debilitación de la memoria y pueden representar las características críticas de las complicaciones neurológicas postoperatorias vistas en muchos pacientes después de cirugía ortopédica. Es importante tener en cuenta que otros procedimientos quirúrgicos se han utilizado para modelar la disfunción cognitiva postoperatoria en ratones. Estos incluyen abdominal31,32,33 y cirugía vascular34 , así como trauma superficial35,36. La técnica de parabiosis es aplicable a todos estos modelos, que comparten similares puntos finales, incluyendo inflamación, activación glial y déficits conductuales, que pueden estar mediados por mecanismos comunes.
Estudios que incluyen parabiosis han revelado nuevos roles de factores circulantes que pueden afectar la función cognitiva, neuroinflamación y rejuvenecimiento de tejidos en animales envejecidos37,38,39,40 ,41,42. Hemos demostrado que parabiosis se puede combinar con éxito con el modelo de fractura tibial descrito aquí para interrogar vías regenerativas y estudiar mecanismos que implican factores transmitidos por la sangre que influencia curación y fractura la reparación de12. Aquí, demostramos que la capacidad de reparación de la fractura de un animal envejecido puede ser rejuvenecida cuando el animal envejecido es anastomosado a un animal joven. Esta reversión de edad tiene su raíz en el engraftment de células hematopoyéticas en el sitio de la fractura. Curiosamente, también podría lograrse tal rejuvenecimiento mediante trasplante de médula ósea joven en ratones envejecidos. En este sentido, trasplante de médula ósea puede considerarse una alternativa más directa y más simple de parabiosis. Sin embargo, la parabiosis es un modelo más robusto para investigar la función de células y factores circulantes. Se espera que una combinación de modelos de cirugía ortopédica y parabiosis jugará un papel importante al responder a preguntas críticas en la atención perioperatoria y Biología del envejecimiento.
En Resumen, presentamos un protocolo paso a paso para un modelo de ratón de fractura tibial para estudiar los mecanismos responsables de neuroinflamación postoperatoria y el deterioro cognitivo después de procedimientos quirúrgicos ortopédicos. Este modelo puede combinarse con un procedimiento de parabiosis para estudiar las interacciones neuro-inmune, regeneración de tejidos y otras vías. Definición de estos mecanismos proporcionará objetivos estratégicos para minimizar los riesgos de complicaciones postoperatorias y optimizar los resultados.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Kathy Gage, BS (Departamento de Anestesiología, Duke University Medical Center, Durham, NC) para asistencia editorial. NT reconoce apoyo de una beca de innovación de sueño de Anestesiología Duque y NIA/NIH R01 AG057525-01.
Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used |
Buprenorphine | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496- 6757-1 | Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | 70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning |
10% povidone Iodine | Dynarex | For antiseptic treatment of skin | |
SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | Low Flow Anesthesia system |
MouseSTAT | Kent Scientific | PS1161 | Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor |
Shaver | Wahl | 9854L | |
Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
Scalpel Handle | Fine science tools | 10003-12 | |
Scalpel Blades – #11 | Fine science tools | 10011-00 | |
Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | Needed for stripping the periosteum |
Iris Forceps | Fine science tools | 11066-07 | Useful (1×2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma |
Bonn Scissors (Straight) | Fine science tools | 14084-08 | Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt |
Fine Scissors | Fine science tools | 14058-09 | Sharp scissors for cutting sutures |
22G x 3.5 In Quincke Spinal Needle | BD | 405181 | Use inner rod for pinning |
Needle Holders | Fine science tools | 12001-13 | |
Suture | Look | 1079B | |
C57BL6/J | Jackson Laboratory | stock no. 000664 | |
eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously) | Jackson Laboratory | stock no. 003291 |