Este protocolo descreve um modelo do rato de cirurgia ortopédica que tem sido usado para estudar os mecanismos de neuroinflammation pós-operatória e alterações comportamentais e quando combinado com parabiosis, para estudar a regeneração de tecidos durante o envelhecimento.
Cirurgia é comumente usada para melhorar e manter a qualidade de vida. Infelizmente, em pacientes vulneráveis como os idosos, as complicações podem ocorrer e diminuir significativamente o resultado. Com efeito, após a cirurgia ortopédica de rotina para reparar uma fratura, até 50% dos pacientes idosos sofrem de complicações neurológicas como delírio. Além disso, a capacidade de curar e regenerar o tecido após a cirurgia diminui com a idade e pode afetar a qualidade do reparo de fratura e até de osseointegração de implantes. Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos que levam a estas mudanças de idade-dependente poderia fornecer alvos estratégicos para minimizar o risco para essas complicações e otimizar os resultados. Aqui, apresentamos um modelo de mouse clinicamente relevantes da fratura da tíbia. As alterações no pós-operatório nestes ratos imitam alguns das deficiências cognitivas comumente observadas após cirurgia ortopédica de rotina em humanos. Brevemente, uma incisão é realizada na extremidade direita do hind sob condições estritamente assépticas. Os músculos são desassociados, e um pino de aço inoxidável-0.38 mm é inserido a crista superior da tíbia, no interior do canal intramedular. Osteotomia, em seguida, é executada, e a ferida é grampeada. Nós usamos este modelo para investigar os efeitos do trauma cirúrgico no pós-operatório neuroinflammation e alterações comportamentais. Aplicando este modelo de fratura em combinação com parabiosis, um modelo cirúrgico no qual são anastomosados 2 ratos, temos estudado as células e fatores secretados que sistemicamente rejuvenescer a regeneração de tecido e função de órgãos após a lesão. Seguindo nosso protocolo passo a passo, estes modelos podem ser reproduzidos com alta fidelidade e podem ser adaptados para interrogar muitas vias biológicas que são alteradas pelo trauma cirúrgico.
Cirurgia transformou-se o sistema de saúde médico e continuamente está contribuindo para a tecnologia de ponta, segurança melhorada e mantida a qualidade de vida. Infelizmente, a cirurgia também induz respostas fisiopatológicas que podem levar a complicações pós-operatórias, incluindo infecções de ferida, deficiências neurológicas e até mesmo mortalidade, especialmente em pacientes idosos,1,2. Cirurgia ortopédica é realizada rotineiramente, especialmente em adultos mais velhos, para melhorar a qualidade de vida e reparar lesões ósseas comuns. No entanto, até 50% dos pacientes de cirurgia ortopédica que são 65 anos e mais velhos experiência de deficiências neurológicas como delírio pós-operatório. Este consistentemente correlaciona-se com mau prognóstico, ou seja, 5-fold aumento do risco de mortalidade em 6 meses, persistente declínio funcional, maior tempo de cada paciente, maior tempo de permanência de hospital e taxas mais elevadas de colocação de repouso de enfermagem 3 , 4 , 5. alguns fatores de risco, incluindo a idade avançada, foram identificados, mas pouco é conhecido sobre os mecanismos responsáveis por deficiências neurológicas após a cirurgia.
Uma vez que as fraturas são muito comuns em idosos, estabelecemos um modelo do rato da fratura da tíbia para determinar o impacto do trauma periférico na recuperação pós-operatória, incluindo neuroinflammation e cérebro saúde (função cognitiva)6, 7. este modelo, originalmente descrito por Harry et al . 8, consiste de fixação intramedular e fratura da tíbia sob anestesia geral e analgesia e, portanto, imita a lesão de pele, trauma muscular, e osso reparar associado com fraturas de ossos longos comuns e reparar nos seres humanos. Após este procedimento, os ratos demonstram alterações em marcadores inflamatórios similares às alterações observadas em seres humanos9,10, bem como a ativação microglial no hipocampo, que está associado com déficits na memória declarativa e Neuroplasticidade hippocampal6,7,11. Nós combinamos anteriormente este modelo de fratura com parabiosis. Parabiosis é um modelo cirúrgico no qual 2 ratos são anastomosados, em assim compartilham um sistema circulatório. Este modelo tem proporcionado um grande avanço na compreensão dos efeitos regulamentares circulantes de células e fatores humorais na função do órgão no contexto da doença e idade12,13,14. Usando essa abordagem recentemente descobrimos sistêmicos fatores associados à fratura de idade-dependente cura12.
Aqui, apresentamos um protocolo que combina o modelo de fratura da tíbia com parabiosis para estudar mecanismos de dependente da idade óssea-para-cérebro, que são relevantes para a medicina regenerativa e neuroimunologia. 1A protocolo descreve o procedimento de parabiosis e protocolo 1B detalhes o procedimento de fratura tibial (figura 1A). Estas podem ser executadas independentemente ou em combinação, dependendo da natureza do interrogatório.
Fraturas são um problema clínico comum e permanecem a principal causa de morbilidade, nomeadamente o rápido crescimento da população sénior. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo para um modelo do rato da fratura da tíbia para estudar os mecanismos responsáveis pela neuroinflammation pós-operatória e comprometimento cognitivo. Este modelo pode ser combinado com cirurgia parabiosis para estudar interações neuro-imune, regeneração de tecidos e outros processos de sinalização. Compreender esses mecanismos fornecerá alvos estratégicos para minimizar os riscos de complicações pós-operatórias e otimizar os resultados.
Vários modelos ortopédicos foram desenvolvidos para estudar a reparação óssea em roedores25. Nós adotado e modificado este procedimento de fratura da tíbia, originalmente descrito por Harry et al . 8, para estudar os efeitos de cirurgia ortopédica na função cerebral. Também usamos este modelo de fratura em combinação com o nosso modelo de parabiosis para investigar os fatores que são responsáveis pela consolidação óssea e a regeneração dos tecidos da idade-dependente. Quando realizada sob anestesia geral volátil, este procedimento de fratura da tíbia requer apenas cerca de 15 min por animal, resulta em zero de mortalidade mínima (dependendo da idade do mouse e susceptibilidade genética subjacente) e recapitula comum insultos associados com fratura de ossos longos e traumas cirúrgicas ortopédicos. Assim, este modelo é ideal para interrogar vias biológicas e executar avaliações longitudinais. No entanto, é fundamental que a osteotomia e fixação são reprodutíveis, e que os danos ao tecido mole são consistente. Danos musculares podem ser modulados, por exemplo por despir o periósteo e a beliscar os músculos ao redor para fazer a cirurgia mais traumático. Modelos de fratura traumática induzido por trauma contuso não fixa ou flexão de três pontos não proporcionaria tal precisão ou consistência. Estes procedimentos geralmente resultam em re-ferimento, o que leva a resposta inflamatória prolongada. Inversamente, os modelos de fratura envolvendo fixação rígida têm uma inflamação mais moderada, o que não totalmente recapitular os danos associados com a cirurgia ortopédica26,27.
Outros modelos usando pinos de liga de titânio foram desenvolvidos para artroplastia humana estreitamente imitar e podem ser mais relevantes para interrogar a instabilidade da prótese, osteólise e complicações associadas a prótese em ratos28,29 . Modelos de furo tais como o apresentado aqui, fornecer estabilização adequada, e os ratos podem ser testados em paradigmas comportamentais sem défices significativos que poderiam confundir tarefas como medo condicionado ou aberto campo locomoção/ansiedade de testes6 ,7,11,15,19,20. No entanto, deformidades rotacionais podem ocorrer se a fixação não é adequadamente bloqueada. Alguns modelos usam um fixador externo, que fornece a estabilização superior, mas é um desafio para implementar em um tibia do rato, embora este possa ser aplicado com sucesso em um rato fêmur27.
Deficiências cognitivas, incluindo delírio e disfunção cognitiva no pós-operatório, são complicações comuns após cirurgia ortopédica para reparação de fratura, especialmente em pacientes idosos e frágeis30. Este modelo de rato clinicamente relevantes da cirurgia de fratura tibial demonstra que citocinas sistêmicas pós-operatórias lançamento6,7,17, prejudicada a barreira sangue – cérebro função15,19 e alterado microglial morfologia16,22, contribuir para a perda de memória e pode representar recursos críticos das complicações neurológicas pós-operatórias vistos em muitos pacientes após cirurgia ortopédica. É importante notar que outros procedimentos cirúrgicos têm sido utilizados para modelar a disfunção cognitiva pós-operatória em ratos. Estes incluem abdominal31,32,33 e cirurgia vascular34 , bem como trauma superficial35,36. A técnica de parabiosis é aplicável a todos esses modelos, que compartilham esses pontos semelhantes, incluindo inflamação, ativação glial e défices comportamentais, que podem ser mediados por mecanismos comuns.
Estudos que incluem parabiosis revelaram novos papéis para fatores circulantes que podem afetar a função cognitiva, neuroinflammation e rejuvenescimento de tecidos em animais envelhecidos37,38,39,40 ,41,42. Temos mostrado que parabiosis pode ser combinado com êxito com o modelo de fratura da tíbia descrito aqui para interrogar vias regenerativas e estudar mecanismos que envolvem fatores pelo sangue que cura de influência e fratura reparar12. Aqui, temos demonstrado que a capacidade de reparação de fratura de um animal envelhecido pode ser rejuvenescida quando o animal envelhecido é anastomosado a um animal jovem. Esta inversão de idade estava enraizada na enxertia das células hematopoiéticas no local da fratura. Curiosamente, tal rejuvenescimento também poderia ser alcançado através do transplante de medula jovem em ratos envelhecidos. A este respeito, transplante de medula óssea pode ser considerada uma abordagem alternativa mais direta e mais simples para parabiosis. No entanto, parabiosis é um modelo mais robusto para investigar a função de células e fatores de circulação. Esperamos que uma combinação de parabiosis e modelos de cirurgia ortopédica desempenhará um papel importante em responder perguntas críticas no cuidado perioperatório e biologia do envelhecimento.
Em resumo, apresentamos um protocolo passo a passo para um modelo do rato da fratura da tíbia para estudar os mecanismos responsáveis pela neuroinflammation pós-operatória e comprometimento cognitivo após procedimentos cirúrgicos ortopédicos. Este modelo pode ser combinado com um procedimento parabiosis para estudar interações neuro-imune, regeneração de tecidos e outros caminhos. Definir esses mecanismos fornecerá alvos estratégicos para minimizar os riscos de complicações pós-operatórias e otimizar os resultados.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Kathy Gage, BS (departamento de Anestesiologia, centro médico da Universidade Duke, Durham, NC) pela assistência editorial. NT reconhece apoio de uma bolsa de inovação do sonho de Anestesiologia Duke e NIH/NIA R01 AG057525-01.
Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used |
Buprenorphine | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496- 6757-1 | Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | 70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning |
10% povidone Iodine | Dynarex | For antiseptic treatment of skin | |
SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | Low Flow Anesthesia system |
MouseSTAT | Kent Scientific | PS1161 | Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor |
Shaver | Wahl | 9854L | |
Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
Scalpel Handle | Fine science tools | 10003-12 | |
Scalpel Blades – #11 | Fine science tools | 10011-00 | |
Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | Needed for stripping the periosteum |
Iris Forceps | Fine science tools | 11066-07 | Useful (1×2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma |
Bonn Scissors (Straight) | Fine science tools | 14084-08 | Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt |
Fine Scissors | Fine science tools | 14058-09 | Sharp scissors for cutting sutures |
22G x 3.5 In Quincke Spinal Needle | BD | 405181 | Use inner rod for pinning |
Needle Holders | Fine science tools | 12001-13 | |
Suture | Look | 1079B | |
C57BL6/J | Jackson Laboratory | stock no. 000664 | |
eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously) | Jackson Laboratory | stock no. 003291 |