A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration

Chao Xiong; Zhiquan Zhang; Gurpreet S. Baht; Niccolo Terrando

doi:10.3791/56701

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Tıp

Ein Maus-Modell der orthopädischen Chirurgie, Postoperative kognitive Dysfunktion und Geweberegeneration zu studieren

Published: February 27, 2018

doi:

10.3791/56701

Chao Xiong¹, Zhiquan Zhang¹, Gurpreet S. Baht^2,3, Niccolo Terrando^1,4

¹Department of Anesthesiology,Duke University Medical Center, ²Department of Orthopaedic Surgery,Duke University Medical Center, ³Duke Molecular Physiology Institute, ⁴Center for Translational Pain Medicine,Duke University Medical Center

Özet

Dieses Protokoll beschreibt ein Maus-Modell der orthopädischen Chirurgie, die verwendet wurde, um die Mechanismen der postoperativen Neuroinflammation und Verhaltensänderungen und in Kombination mit Parabiosis, Geweberegeneration während des Alterns zu studieren studieren.

Abstract

Chirurgie wird häufig zur Verbesserung und Erhaltung der Lebensqualität. Bei gefährdeten Patienten wie ältere Menschen, können leider Komplikationen auftreten und das Ergebnis deutlich zu verringern. In der Tat, nach Routine orthopädische Chirurgie, eine Fraktur zu reparieren, weniger als 50 % der älteren Patienten leiden neurologische Komplikationen wie Delirium. Auch die Fähigkeit zu heilen und regenerieren Gewebe nach der Operation mit dem Alter abnimmt, und kann Auswirkungen auf die Qualität der Fraktur Reparatur- und sogar knöcherner Integration von Implantaten. So könnte ein besseres Verständnis der Mechanismen, die diese Altersabhängige Veränderungen bieten strategische Ziele zur Risikominimierung für solche Komplikationen und Ergebnisse zu optimieren. Hier stellen wir eine klinisch relevante Mausmodell der tibiale Fraktur. Die postoperative Veränderungen in diesen Mäusen ahmen einige der kognitiven Beeinträchtigungen häufig nach Routine orthopädische Chirurgie beim Menschen beobachtet. Kurz gesagt, ist ein Schnitt in der rechten hinteren Extremität unter streng aseptischen Bedingungen durchgeführt. Muskeln sind aufgehoben, und eine 0,38 mm Edelstahl-Pin in das obere Wappen der Tibia, im Inneren der intramedullären Kanal eingefügt wird. Osteotomie erfolgt dann, und die Wunde wird geheftet. Wir haben dieses Modell verwendet, um die Auswirkungen der chirurgische Trauma auf postoperative Neuroinflammation und Verhaltensänderungen zu untersuchen. Durch die Anwendung dieser Fraktur-Modell in Kombination mit Parabiosis, eine chirurgische Modell, in dem 2 Mäuse anastomosieren sind, haben wir untersucht, Zellen und sezernierten Faktoren, die systemisch Organ Funktion und Geweberegeneration nach Verletzungen zu regenerieren. Folgen Sie unserer Schritt für Schritt-Protokoll, diese Modelle mit hoher Wiedergabetreue reproduziert werden können, und lässt sich zu vielen biologische Bahnen zu befragen, die durch chirurgische Trauma verändert werden.

Introduction

Chirurgie hat die medizinische Gesundheitssystem verwandelt und trägt kontinuierlich zur Spitzentechnologie, verbesserte Sicherheit und Lebensqualität gepflegt. Leider induziert Chirurgie auch pathophysiologische Reaktionen, die postoperative Komplikationen einschließlich Wundinfektionen, neurologische Beeinträchtigungen und sogar die Sterblichkeit, insbesondere in älteren Patienten¹^,²führen kann. Orthopädische Chirurgie erfolgt regelmäßig, vor allem bei älteren Erwachsenen, um Lebensqualität zu verbessern und gemeinsame Knochenverletzungen zu reparieren. Jedoch bis zu 50 % der orthopädischen Chirurgiepatienten, die 65 Jahre und älter Erfahrung neurologische Beeinträchtigungen wie postoperative Delirium. Dies erhöht konsequent korreliert mit schlechter Prognose, d. h., 5-fold erhöhtes Risiko für Mortalität nach 6 Monaten, anhaltende funktionelle Rückgang, Pflege-Zeit pro Patient, erhöhte Dauer des Krankenhausaufenthalts und höhere Raten von Pflegeheim Platzierung ³ ^, ⁴ ^, ⁵. einige Risikofaktoren, einschließlich des fortgeschrittenen Alters identifiziert worden, aber wenig bekannt über die Mechanismen, die für neurologische Beeinträchtigungen nach der Operation.

Da Frakturen sehr häufig bei älteren Menschen sind, haben wir ein Maus-Modell der tibiale Fraktur zu bestimmen, die Auswirkungen der peripheren Trauma auf postoperative Genesung, einschließlich Neuroinflammation und Gehirn Gesundheit (kognitive Funktion)⁶^, etabliert. ⁷. dieses Modell ursprünglich von Harry Et Al. beschrieben ⁸, besteht aus intramedulläre anheften und tibiale Fraktur unter allgemeiner Anästhesie und Analgesie und imitiert somit die Hautverletzungen, Muskeltrauma, und Knochen reparieren verbunden mit gemeinsamen Frakturen der langen Röhrenknochen und reparieren beim Menschen. Nach dieser Prozedur Mäuse zeigen Veränderungen in Entzündungsmarker ähnlich wie Menschen⁹^,¹⁰, sowie Mikroglia-Aktivierung im Hippocampus, die im Zusammenhang mit Defiziten im deklarativen Gedächtnisses beobachteten Veränderungen und hippocampal Neuroplastizität⁶^,⁷^,¹¹. Bisher haben wir diese Fraktur-Modell mit Parabiosis kombiniert. Parabiosis ist eine chirurgische Modell in dem 2 Mäuse sind anastomosieren und deshalb ein Herz-Kreislauf-System. Dieses Modell hat einen Durchbruch im Verständnis der rechtlichen Auswirkungen der zirkulierenden Zellen und humorale Faktoren auf die Organfunktion im Zusammenhang von Alter und Krankheit¹²^,¹³^,¹⁴zur Verfügung gestellt. Mit diesem Ansatz haben wir systemische Faktoren im Zusammenhang mit altersabhängigen Frakturheilung¹²kürzlich entdeckt.

Hier stellen wir eine Protokoll, die verbindet das tibiale Fraktur-Modell mit Parabiosis, Knochen, Gehirn altersabhängigen Mechanismen zu untersuchen, die für regenerative Medizin und Neuroimmunologie relevant sind. Protokoll-1A beschreibt das Parabiosis Verfahren und die Protokolldetails 1 b das tibiale Fraktur Verfahren (Abbildung 1A). Diese können unabhängig voneinander oder in Kombination, je nach Art der Vernehmung durchgeführt werden.

Protocol

Alle Tierversuche wurden im Einklang mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und genehmigt von der institutionellen Animal Care & Verwendung Committee (IACUC) an der Duke University. (1) Versuchstiere Halten Sie Mäuse in einer klimatisierten Umgebung mit 12-h-hell/dunkel-Zyklen und angemessenen Zugang zu standard Nahrung und Wasser. Haus nicht mehr als 5 Wurfgeschwistern pro Käfig, und vermeiden Sie Bedingungen, die die Kämpfe fördern könnte. Weibchen C57BL6/J Mäusen in 3 Monate alt (jung) oder 18 Monate alt (alt) verwenden. Akklimatisieren Sie für Parabiosis 2 Mäuse zusammen für mindestens zwei Wochen vor der Operation. Mäuse sind entweder Wild-Typ C57BL6/J oder eGFP +. Überprüfen Sie die Körperkondition und Gesamterscheinung der Mäuse täglich. 2. präoperative Setup für Parabiosis und orthopädische Chirurgie Wiegen Sie die 2 Mäuse. Allgemeinen Anästhesie über ein Anästhesiesystem mit einer konstanten O2 Flow Rate von 0,2 L/min. Einsatz 5 % Isofluran für Induktion in einer Induktion Kammer zu verwalten.Hinweis: Die Tiefe der Narkose kann mit einer Zehe Klemme bestätigt werden. Legen Sie die Mäuse auf eine beheizte in Rückenlage. Verwenden Sie eine rektale Sonde Körpertemperatur während des chirurgischen Verfahrens zu überwachen. Um Anästhesie erhalten, senken Sie die eingeatmete Konzentration von Isofluran auf 2,0 % in 0,2 L/min durch eine Gesichtsmaske. Monitor auf ausreichende Tiefe der Narkose zu gewährleisten. Physiologische Parameter (Atemfrequenz, Sauerstoffsättigung und Herz schlagen) nicht-invasiv mit einer Pulsoximeter (optional)zu überwachen. 3. Parabiosis Chirurgie (Protokoll 1A) Analgesie zu verwalten (Buprenorphin, SR/langsam loslassen, 0,1 mg/kg subkutan) nach Induktion und vor chirurgischen Manipulation. Bupivacain (0,25 %) an den Flanken kurz vor dem Öffnen zu injizieren. Wenden Sie Auge Schmiermittel.Hinweis: Das Parabiosis-Protokoll kann unabhängig von der tibiale Fraktur durchgeführt werden. Verwenden Sie für alle internen Körper Nähen 4-0 Polydioxanon Nahtmaterial. Verwenden Sie für alle externen vernähen Polypropylen Nahtmaterial 4-0. Rasieren Sie die 2 Mäuse entlang einer zusammenhängenden Linie von den Ellenbogen, die Flanke und das Knie auf der Seite verbunden werden. Mit Jod desinfizieren + 70 % Alkohol Haut Scheuern über 3 wechselnden Zyklen in der Vorbereitung für Schnitt.Verwendet autoklaviert Instrumente und pflegen einen sterilen Bereich.Hinweis: Der Wildtyp Maus auf der rechten Seite der eGFP Maus und der linken Flanke der Wildtyp Maus und die Rechte Flanke der eGFP Maus für Chirurgie (Abbildung 1) vorbereiten. Verwenden Sie auf jede Maus eine Schere, um einen Hautschnitt entlang der Flanke, proximal bis zum Knie, nur proximal bis zum Ellenbogen und ohne zu stören die Muskeln unter der Haut bis hin zu machen. Begleiten Sie die Trizeps der Tiere mit 2 unterbrochenen Nähten. Begleiten Sie die Wände entlang der Flanken mit einer laufenden, kontinuierliche Naht 7-9 Pässe. Begleiten Sie die Quadrizeps des Tieres mit 2 unterbrochenen Nähten. Schließen Sie die Haut von den 2 Parabionts mit unterbrochenen Nähten. Lassen Sie die Mäuse in der Umgebungsluft zu wecken. Um Erfolg dieses Protokolls zu gewährleisten, die Gesundheit der Paare einzuhalten: überwachen Sie die Paare täglich; durchführen Sie körperliche Verfassung erzielte zweimal wöchentlich; und wiegen die Paare zweimal in der Woche.Hinweis: Jedes Paar ist einzeln untergebracht.Hinweis: Wenn regelmäßige Buprenorphin (dh nicht SR/slow Release) verwenden dann verwalten Sie 0,1 mg/kg subkutan in 1 mL Kochsalzlösung pro Maus zweimal täglich für 3 Tage. Lassen Sie 4 Wochen Erholungszeit freigegebenen Verkehr zwischen Parabionts wenn tibiale Fraktur Chirurgie durchführen ermöglichen. 4. tibiale Fraktur Chirurgie (Protokoll 1 b) Analgesie zu verwalten (Buprenorphin, 0,1 mg/kg subkutan) nach Induktion und vor chirurgischen Manipulation. Bupivacain (0,25 %) an der Operationsstelle proximal bis zum Knie kurz vor der Eröffnung zu injizieren. Wenden Sie Auge Schmiermittel. Den mediale Aspekt der richtigen Hind Extremität der Maus auf den OP-Bereich setzen rasieren und desinfizieren mit Jod + 70 % Alkohol Haut Peeling über 3 Zyklen abwechseln. Pflegen Sie ein steriles Operationsfeld während des Verfahrens. Um Verschmutzung zu begrenzen; Verwenden Sie autoklaviert Instrumente und Handschuhe; Füllen Sie die Operation unter dem sezierenden Mikroskop (fakultativ); und verwenden Sie ein Heizkissen auf um Körpertemperatur zu halten.Hinweis: Wenn das Protokoll auf Parabionts durchgeführt wird, ist nur 1 Maus im Paar (der rechten Tibia von der rechten Maustaste) gebrochen. Siehe Abbildung 1 b für eine schematische Darstellung der Fraktur auf Parabionts. Verwenden Sie eine Schere um einen Hautschnitt entlang der medialen Aspekt der richtigen Hind Extremität proximal bis zum Knie hinunter die Midshaft der Tibia auf die Rechte Maustaste. Setzen Sie die Midshaft der Tibia und lokalisieren Sie visuell der Diaphyse. Biegen Sie die Knie und visualisieren Sie die tibiale Plateau mit der Patella-femoralen Bänder als Wahrzeichen. Visualisieren Sie die Patellasehne; Bohren Sie manuell durch Walzen von Daumen und Zeigefinger ein 0,5-mm-Loch in der intramedullären Kanal mit einer 25-Gauge-Nadel.Hinweis: Die Bohrung wird parallel entlang der Tibia in die Tibia Plateau durchlaufen. Legen Sie eine 0,38 mm Edelstahl-Pin durch das Loch ca. 15 mm in die Markhöhle bis Widerstand spüren, und schneiden Sie bündig mit der Tibia Plateau mit einem Drahtschneider (siehe ergänzende Video 1 für eine 3D-Rekonstruktion). Mit geraden Bonn Schere, Fraktur der Tibia Midshaft (Diaphyse). Siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung der Fraktur. Beobachten Sie visuell die Frakturstelle und angrenzenden Gewebe zur Stabilisierung der Fraktur Anblick zu inspizieren. Schließen Sie mit dermalen Heftklammern. Legen Sie die Mäuse auf beheizten Pads zu erholen vor der Rückgabe an einen Käfig sauber nach Hause. 1 mL vorgewärmt (37 ° C) normale Kochsalzlösung subkutan in jeder Maus für Flüssigkeitsersatz zu injizieren. Überprüfen Sie Mäuse täglich auf Anzeichen von Lahmheit, Infektionen oder Blutungen.Hinweis: Wenn regelmäßige Buprenorphin (dh nicht SR/slow Release) verwenden dann verwalten Sie 0,1 mg/kg subkutan in 1 mL Kochsalzlösung täglich für 3 Tage.

Representative Results

Nachdem transversale Osteotomien unter sterilen Bedingungen mit stetigen einsetzen der Stifte und richtige Naht sorgfältig durchgeführt wurden, zeigten Mäuse keinerlei Anzeichen von Lahmheit, Infektionen oder Blutungen in das linke Bein nach der Operation. Orthopädische Heilung wurde anhand radiographische Analyse und Histomorphometrie nach Safranin-O Färbung (Abbildung 2). Röntgenbilder der midshaft gebrochenen Tibiae angegeben mehr Gewebe Ablagerung in der Fraktur Schwielen von jungen Mäusen als in der Fraktur Schwielen von gealterten Mäusen. Fraktur Schwielen waren entkalkt und eingebettet in Paraffin in Vorbereitung für die histologische Analyse. Abschnitte wurden mit Safranin-O befleckt und Gewebe Abscheidung wurde quantifiziert mittels Histomorphometrie Analyse. Fraktur Schwielen von jungen Mäusen enthalten mehr Knochen und weniger fibrotische Gewebe als Fraktur Schwielen von gealterten Mäusen. Tibiale Fraktur induziert systemische und zentrale Entzündung6,7,11,15,16. In der Tat sind periphere Ebenen von Pro-inflammatorischen Zytokinen und Gefahr-assoziierte molekulare Muster (DAMPs) schnell nach orthopädischen Operationen, sowohl in Mäusen und Menschen7,17,18erhöht. Dies trägt zur Aktivierung der Mikroglia-Zellen in das Gehirn über mehrere Signalisierung Mechanismen, bei denen humorale, zelluläre und neuronale Bahnen7,15,19,20, 21. Nach Chirurgie, endothelialen Dysfunktion, Öffnung der Blut – Hirn-Schranke und peripheren Makrophagen Infiltration beitragen, akute hippocampal Neuroinflammation in Wild-Typen und Ccr2RFP / + Cx3cr1GLP / + erwachsener Mäuse15 , 19, und nachfolgende Gedächtnisdefizite, die menschlichen Delirium und postoperative kognitive Dysfunktion15,19,22ähneln zugeordnet wurden. Verschlimmert wird diese schwere Reaktion bei alten Tieren mit erheblichen Änderungen in der Mikroglia Morphologie, wie von IBA-1 Immunostaining (Abbildung 3) erkannt. Mit Hilfe der tibiale Fraktur-Modells beschrieben hier fanden wir auch vorübergehend beeinträchtigt hippocampale Neurogenese, wie einen Rückgang der Doublecortin (DCX) Immunostaining im dentate Gyrus20belegt. Elektrophysiologische Messungen der Langzeitpotenzierung (LTP), ein Surrogat für Memory-Funktion, offenbart eine Unterbrechung des zeitabhängigen Neuroplastizität postoperativ11. Mäusen nach der Operation zeigen auch Beeinträchtigungen im Hippokampus-abhängige Memory-Funktion, zum Beispiel mit Angst Konditionierung behavioral Beurteilung (Abbildung 4). Bei der Konditionierung von Angst, sind Mäuse in eine Kammer gelegt und eine auditive Cue, gefolgt von einen aversiven Reiz (d.h. Fußreiz) ausgesetzt. Drei Tage nach der Operation tibiale, Mäuse sind in der Klimaanlage Kammer, diesmal ohne auditive oder aversive Stimulation, getestet und Einfrieren Verhalten wird als Index des Speichers (für ein detailliertes Protokoll siehe23) aufgezeichnet. Fortgeschrittenen Alter ist ein Risikofaktor für Speicher Rückgang. Doch wenn wir älter werden, verringert sich die Kapazität für die Reparatur von Gewebe und Regeneration auch obwohl diese Mechanismen schlecht verstanden bleiben. So wir verwendet die Protokolle, die hier beschriebenen Heterochronic Parabiosis (jung/alt Tiere Paarung) ausführen und Frakturheilung innerhalb der alten Maus (für eine detaillierte Parabiosis Protokoll siehe24) bewertet. Blut-sharing zwischen parabiotischer Paaren wurde bestätigt und festgestellt, dass gleich12. Exposition gegenüber einer jugendlich Zirkulation verbessert Knochen Reparatur mit früheren Union erhöht Knochen Ablagerung und Fibrose (Abbildung 5)12verringert. Diese Verjüngung der Knochenregeneration aufgetreten ist unabhängig von der endogenen Osteocalcin-positiven Osteoblasten (Abbildung 5, braun-Zellen), aber eher auf CD45-positiven Zellen, die von den jungen Parabiont (Abbildung 5, blaue Zellen) migriert . Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die CD45-positiven hämatopoetischen Zellen junge und gesunde Nische, absondern, die gealterten osteoblastischen Zellen veranlassen signalisieren, aktiver zu werden vermag. Abbildung 1: Schematische Darstellung der Parabiosis und tibiale Fraktur Chirurgie. (A) Zeitplan für die Durchführung von Parabiosis und tibiale Fraktur (Protokoll 1A) oder tibiale Fraktur allein (Protokoll 1 b). (B) Tibiae von 20 Monate alten Mäusen Isochronic oder Heterochronic parabiotischer paarweise waren gebrochen (rechtes Bein von der rechten Maustaste ist gebrochen, wie mit einem X gekennzeichnet). Graue Mäuse zeigen Wildtyp-Mäusen, während grüne Mäuse eGFP-Mäusen zeigen. (C) schematische Darstellung der tibiale Fraktur Modell mit intramedullären anheften und die Mitte Welle Frakturierung. Siehe auch ergänzende Video 1 für eine 3D-Rekonstruktion der hinteren Gliedmaßen und fixieren des Schienbeins. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: tibiale Frakturheilung innerhalb von jung und alt Mausmodellen. Die Tibiae von jungen oder alten Mäusen waren gebrochen und Fraktur Schwielen waren untersuchten 21 Tage Post Verletzungen. (A) radiologische Bildgebung und histologische Färbung (Safranin-O) wurden verwendet, um die Fraktur Schwielen 21 Tage Post Fraktur zu bewerten. Färbung zeigt kollagenen Gewebe in blau und Proteoglykane (Knorpel enthaltenen) in rot. Gestrichelte Linien zeigen ungefähre Lage der Fraktur Kallus. (B) Histomorphometrie wurde verwendet, um die Menge von Knochen, Knorpel und fibrotische Gewebe innerhalb der Fraktur Kallus 21 Tage Post Fraktur hinterlegt zu beurteilen. Daten werden ausgedrückt als ± 95 %-Konfidenzintervall bedeuten * P < 0,05, statistisch signifikant (One-Way ANOVA, Dunnett Test), Maßstabsleisten repräsentieren 2 mm, und Bilder wurden mit einem Mikroskop, 1,25 X Objektiv. n = 9 für jede Probe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Operation induzierte altersabhängigen Mikroglia-Aktivierung im Hippocampus. Tibiale Fraktur Chirurgie induziert größere hippocampal Neuroinflammation im Alter Mäuse (20 Monate alt) im Vergleich zu 4-Monate-alten C57BL6/J Mäusen. Gehirn-Abschnitt mit Mikroglia Marker IBA-1 Färbung zeigt mehr positive Zellen und morphologische Veränderungen im operativen Gruppen 24 h nach der Operation. Bilder wurden mit einem Epifluorescent Mikroskop mit einer Vergrößerung von 100 X.; Maßstabsleiste stellt 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Neurogenese Langzeitpotenzierung und Memory-Funktion nach der tibiale Fraktur Operation beeinträchtigt. (A) DCX, ein quantitativer Marker für die Neurogenese, im Hippocampus dentate Gyrus bei 24 h nach der Operation deutlich reduziert. Bilder wurden mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop-Ziel mit einer Vergrößerung von 10 X erhalten; Skala bar stellt 10 µm. (B) Elektrophysiologie in hippocampal Scheiben von Steuerelementen oder Mäuse 24 h nach der Operation. Langzeitpotenzierung (LTP) wurde induziert durch hochfrequente Stimulation (HFS) und verzeichnete mehr als 1 h Feld exzitatorischen postsynaptischen Potenziale (fEPSPs) wurden von der CA1 Stratum Radiatum mit einer extrazellulären Aufnahme Pipette gefüllt mit regelmäßigen künstliche Liquor cerebrospinalis. 24 Stunden nach der Operation ist LTP Induktion bemerkenswert im Vergleich zu Kontroll-Mäusen reduziert. Daten sind als Mittelwert ± s.e.m n ausgedrückt = 3, * p < 0,05 1-Way ANOVA. (C) Hippocampal-abhängige Memory-Funktion (definiert als % des Einfrierens mit Trace fürchten Klimaanlage) ist bei Mäusen nach der Operation im Vergleich zu Kontrollen und Tieren auf die Anästhesie nur eingeschränkt. Daten sind als Mittelwert ± s.e.m n ausgedrückt = 9-10, * p < 0,05 1-Way ANOVA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5: Parabiosis Chirurgie führt zur Verjüngung der Bruch heilen, Blut-sharing und Spender-Zelle Engraftment. Isochronic und Heterochronic Parabiosis-Paarungen wurden errichtet und die alte Maus in jedem Paar war gebrochen und für die Knochenheilung bewertet. (A) Fraktur Schwielen mit radiologischen Bildgebung untersucht wurden. Gestrichelte Linien zeigen ungefähre Lage der Fraktur Kallus. (B) Engraftment eGFP + Zellen bestätigte sich im Knochenmark. (C) Immunohistochemistry der Fraktur Kallus wurde verwendet, um die Spenderzellen eGFP+ (blau) und Osteocalcin+ osteoblastischen Zellen (braun) aus der Parabiont zu identifizieren. Maßstabsleisten repräsentieren 50 µm und Bilder wurden mit einem 40 X Objektiv. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Ergänzende Video 1: 3D-Rekonstruktion der hinteren Extremität und fixieren des Schienbeins. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Discussion

Frakturen sind ein gemeinsames klinisches Problem und bleiben eine der Hauptursachen für Morbidität, insbesondere die rasch wachsende ältere Bevölkerung. Hier stellen wir eine Schritt für Schritt Protokoll für ein Maus-Modell der tibiale Fraktur Mechanismen verantwortlich für postoperative Neuroinflammation und kognitiver Beeinträchtigung zu studieren. Dieses Modell ist kombinierbar mit Parabiosis Chirurgie, Neuro-immunen Interaktionen, Geweberegeneration und andere Signalisierung Prozesse zu studieren. Das Verständnis dieser Mechanismen bieten strategische Ziele zur Minimierung der Risiken für postoperative Komplikationen und Ergebnisse zu optimieren.

Verschiedene orthopädische Modelle wurden entwickelt, um Knochen-Reparatur in Nagetieren²⁵zu studieren. Wir verabschiedeten und modifiziert diese tibiale Fraktur-Verfahren, das ursprünglich von Harry Et Al. beschrieben ⁸, Studie zu Auswirkungen der orthopädischen Chirurgie auf die Gehirnfunktion. Wir haben auch zur dieser Fraktur-Modell in Kombination mit unserem Parabiosis Modell um Faktoren zu untersuchen, die für die Knochenheilung und altersabhängigen Geweberegeneration verantwortlich sind. Wenn flüchtige Vollnarkose durchgeführt, dieses tibiale Fraktur-Verfahren erfordert nur ca. 15 min pro Tier, Ergebnisse in Null bis minimal Sterblichkeit (je nach Alter der Maus oder der zugrunde liegende genetische Empfindlichkeiten) und gemeinsame rekapituliert Beleidigungen mit langer Knochenbruch und orthopädische chirurgische Trauma verbunden. Somit ist dieses Modell ideal für Abfragen biologischer Signalwege und längs Bewertungen durchführen. Es ist jedoch wichtig, dass die Osteotomie und anheften reproduzierbar sind und die Schäden an den Weichteilen steht im Einklang. Weiches Gewebeschaden kann zum Beispiel durch Abstreifen der Knochenhaut und kneifen umgebende Muskeln um die Operation mehr traumatisch moduliert werden. Modelle der traumatische Fraktur durch stumpfes Trauma nicht fixierten oder drei-Punkt-Biegung induziert würde nicht solche Konsistenz und Genauigkeit liefern. Diese Verfahren führen oft zu Re-Verletzung, die zu anhaltenden Entzündungsreaktion führt. Umgekehrt haben Modelle der Fraktur mit starren Fixierung eine gemäßigtere Entzündung, die nicht vollständig die Schäden im Zusammenhang mit orthopädischen Chirurgie²⁶^,²⁷rekapitulieren.

Andere Modelle mit Titan-Legierung anheften, eng mimischen menschlichen Endoprothetik entwickelt wurden und möglicherweise relevanter zu verhören Prothese Instabilität, Osteolyse und Prothese-assoziierten Komplikationen bei Mäusen²⁸^,²⁹. Bohrloch Modelle wie die hier vorgestellte bieten ausreichende Stabilisierung und Mäuse können in behavioral Paradigmen ohne erhebliche Defizite, die Aufgaben wie das durcheinander bringen konnte getestet werden fürchten Klimaanlage oder offenen Bereich Fortbewegung/Angst Tests⁶ ^,⁷^,¹¹^,¹⁵^,¹⁹^,²⁰. Rotations-Deformitäten können jedoch auftreten, wenn die Fixierung nicht richtig verriegelt ist. Einige Modelle verwenden ein Fixateur externe, die bietet überlegene Stabilisierung, sondern ist eine Herausforderung, die Umsetzung in eine Maus Tibia, obwohl es in einer Maus Femur²⁷erfolgreich umgesetzt werden kann.

Kognitive Beeinträchtigungen, einschließlich Delirium und postoperative kognitive Dysfunktion sind häufige Komplikationen nach orthopädischen Chirurgie zur Reparatur der Fraktur, insbesondere ältere und gebrechliche Patienten³⁰. Diese klinisch relevante Mausmodell der tibiale Fraktur Chirurgie zeigt, dass postoperative systemische Zytokin Release⁶^,⁷^,¹⁷, Blut – Hirn-Schranke Funktion¹⁵^,¹⁹ beeinträchtigt , und verändert Mikroglia Morphologie¹⁶^,²², dazu beitragen, die Beeinträchtigung des Gedächtnisses, und möglicherweise kritische Funktionen der postoperativen neurologischen Komplikationen gesehen bei vielen Patienten nach orthopädischen Operationen dar. Es ist wichtig zu beachten, dass andere chirurgischen Verfahren eingesetzt wurden, um postoperative kognitive Dysfunktion bei Mäusen zu modellieren. Dazu gehören Bauch-³¹^,³²^,³³ und vaskuläre³⁴ Chirurgie sowie oberflächliche Trauma³⁵^,³⁶. Die Parabiosis Technik ist anwendbar auf alle Modelle, die teilen ähnliche Endpunkte, einschließlich Entzündung, glialen Aktivierung und Verhaltensstörungen Defizite, die durch gemeinsame Mechanismen vermittelt werden können.

Studien, die Parabiosis enthalten haben neue Rollen für zirkulierende Faktoren ergeben, die kognitive Funktion und Neuroinflammation Gewebe Verjüngung Alter Tiere³⁷^,³⁸^,³⁹^,^{40 auswirken können} ^,⁴¹^,⁴². Wir haben gezeigt, dass die Parabiosis erfolgreich kombiniert werden kann, mit dem hier beschriebenen Verhören regenerative Wege und Mechanismen, bei denen Blut übertragbare Faktoren, die Einfluss Heilung und Fraktur¹²reparieren zu studieren tibiale Fraktur-Modell. Hier haben wir gezeigt, dass die Fraktur-Reparatur-Kapazität des Tieres im Alter von verjüngt werden kann, wenn das alte Tier, ein junges Tier anastomosieren ist. Diese Umkehrung der Alter wurzelte in der Engraftment des blutbildenden Zellen am Bruchaufstellungsort. Interessanterweise konnte diese Verjüngung auch durch Transplantation von jungen Knochenmark in Alter Mäuse erreicht werden. Knochenmark-Transplantation kann in dieser Hinsicht einen direkten und einfacheren alternativen Ansatz zur Parabiosis angesehen werden. Parabiosis ist jedoch ein robusteres Modell zur Untersuchung der Funktion der zirkulierenden Zellen und Faktoren. Wir erwarten, dass eine Kombination aus Parabiosis und orthopädische Chirurgie-Modelle eine wichtige Rolle bei der Beantwortung kritischer Fragen Perioperative Pflege und Biologie des Alterns.

Zusammenfassend lässt sich sagen stellen wir Ihnen eine Schritt für Schritt Protokoll für ein Maus-Modell der tibiale Fraktur Mechanismen verantwortlich für postoperative Neuroinflammation und kognitiver Beeinträchtigung nach orthopädischen Operationsverfahren zu studieren. Dieses Modell ist kombinierbar mit einem Parabiosis Verfahren, Neuro-immunen Interaktionen, Geweberegeneration und andere Wege zu studieren. Definieren diese Mechanismen bieten strategische Ziele zur Minimierung der Risiken für postoperative Komplikationen und Ergebnisse zu optimieren.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Kathy Gage, BS (Abteilung für Anästhesiologie, Duke University Medical Center, Durham, NC) für die redaktionelle Unterstützung. NT erkennt Unterstützung durch einen Traum-Innovation-Zuschuss von Duke Anästhesiologie und NIH/NIA R01 AG057525-01.

Materials

Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-017-25	Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used
Buprenorphine	Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals	NDC 12496- 6757-1	Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations
Ethanol	Fisher Scientific	04-355-451	70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning
10% povidone Iodine	Dynarex		For antiseptic treatment of skin
SomnoSuite	Kent Scientific	SS-01	Low Flow Anesthesia system
MouseSTAT	Kent Scientific	PS1161	Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor
Shaver	Wahl	9854L
Stereomicroscope	Leica	MZ6
Scalpel Handle	Fine science tools	10003-12
Scalpel Blades – #11	Fine science tools	10011-00
Adson Forceps	Fine science tools	11006-12	Needed for stripping the periosteum
Iris Forceps	Fine science tools	11066-07	Useful (1×2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma
Bonn Scissors (Straight)	Fine science tools	14084-08	Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt
Fine Scissors	Fine science tools	14058-09	Sharp scissors for cutting sutures
22G x 3.5 In Quincke Spinal Needle	BD	405181	Use inner rod for pinning
Needle Holders	Fine science tools	12001-13
Suture	Look	1079B
C57BL6/J	Jackson Laboratory	stock no. 000664
eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously)	Jackson Laboratory	stock no. 003291

Referanslar

Terrando, N., et al. Perioperative cognitive decline in the aging population. Mayo Clin Proc. 86 (9), 885-893 (2011).
Lord, J. M., et al. The systemic immune response to trauma: an overview of pathophysiology and treatment. Lancet. 384 (9952), 1455-1465 (2014).
Inouye, S. K., Westendorp, R. G., Saczynski, J. S. Delirium in elderly people. Lancet. 383 (9920), 911-922 (2014).
Han, J. H., et al. Delirium in the emergency department: an independent predictor of death within 6 months. Ann Emerg Med. 56 (3), 244-252 (2010).
Marcantonio, E. R., Flacker, J. M., Wright, R. J., Resnick, N. M. Reducing delirium after hip fracture: a randomized trial. J Am Geriatr Soc. 49 (5), 516-522 (2001).
Cibelli, M., et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 68 (3), 360-368 (2010).
Terrando, N., et al. Tumor necrosis factor-alpha triggers a cytokine cascade yielding postoperative cognitive decline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20518-20522 (2010).
Harry, L. E., et al. Comparison of the healing of open tibial fractures covered with either muscle or fasciocutaneous tissue in a murine model. J Orthop Res. 26 (9), 1238-1244 (2008).
Hirsch, J., et al. Perioperative cerebrospinal fluid and plasma inflammatory markers after orthopedic surgery. J Neuroinflammation. 13 (1), 211 (2016).
Neerland, B. E., et al. Associations Between Delirium and Preoperative Cerebrospinal Fluid C-Reactive Protein, Interleukin-6, and Interleukin-6 Receptor in Individuals with Acute Hip Fracture. J Am Geriatr Soc. 64 (7), 1456-1463 (2016).
Terrando, N., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 prevents surgery-induced cognitive decline. FASEB J. 27 (9), 3564-3571 (2013).
Baht, G. S., et al. Exposure to a youthful circulaton rejuvenates bone repair through modulation of beta-catenin. Nat Commun. 6, 7131 (2015).
Brack, A. S., et al. Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis. Science. 317 (5839), 807-810 (2007).
Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90 (2011).
Terrando, N., et al. Resolving postoperative neuroinflammation and cognitive decline. Ann Neurol. 70 (6), 986-995 (2011).
Terrando, N., et al. Stimulation of the alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Protects against Neuroinflammation after Tibia Fracture and Endotoxemia in Mice. Mol Med. 20 (1), 667-675 (2015).
Vacas, S., Degos, V., Tracey, K. J., Maze, M. High-mobility group box 1 protein initiates postoperative cognitive decline by engaging bone marrow-derived macrophages. Anesthesiology. 120 (5), 1160-1167 (2014).
Zhang, Q., et al. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 464 (7285), 104-107 (2010).
Degos, V., et al. Depletion of bone marrow-derived macrophages perturbs the innate immune response to surgery and reduces postoperative memory dysfunction. Anesthesiology. 118 (3), 527-536 (2013).
Zhang, M. D., et al. Orthopedic surgery modulates neuropeptides and BDNF expression at the spinal and hippocampal levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (43), E6686-E6695 (2016).
Lu, S. M., et al. S100A8 contributes to postoperative cognitive dysfunction in mice undergoing tibial fracture surgery by activating the TLR4/MyD88 pathway. Brain Behav Immun. 44, 221-234 (2015).
Feng, X., et al. Microglia mediate postoperative hippocampal inflammation and cognitive decline in mice. JCI Insight. 2 (7), e91229 (2017).
Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J. Trace fear conditioning in mice. J Vis Exp. (85), (2014).
Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
Ning, B., et al. Surgicallyinduced mouse models in the study of bone regeneration: Current models and future directions (Review). Mol Med Rep. 15 (3), 1017-1023 (2017).
Giannoudis, P. V., Einhorn, T. A., Marsh, D. Fracture healing: the diamond concept. Injury. 38, S3-S6 (2007).
Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
Yang, S. Y., et al. Murine model of prosthesis failure for the long-term study of aseptic loosening. J Orthop Res. 25 (5), 603-611 (2007).
Zhang, T., et al. The effect of osteoprotegerin gene modification on wear debris-induced osteolysis in a murine model of knee prosthesis failure. Biomaterials. 30 (30), 6102-6108 (2009).
AGS/NIA Delirium Conference Writing Group, Planning Committee and Faculty. The American Geriatrics Society/National Institute on Aging Bedside-to-Bench Conference: Research Agenda on Delirium in Older Adults. J Am Geriatr Soc. 63 (5), 843-852 (2015).
Li, Y., et al. Deferoxamine regulates neuroinflammation and iron homeostasis in a mouse model of postoperative cognitive dysfunction. J Neuroinflammation. 13 (1), 268 (2016).
Tang, J. X., et al. Modulation of murine Alzheimer pathogenesis and behavior by surgery. Ann Surg. 257 (3), 439-448 (2013).
Ren, Q., et al. Surgery plus anesthesia induces loss of attention in mice. Front Cell Neurosci. 9, 346 (2015).
Fan, D., Li, J., Zheng, B., Hua, L., Zuo, Z. Enriched Environment Attenuates Surgery-Induced Impairment of Learning, Memory, and Neurogenesis Possibly by Preserving BDNF Expression. Mol Neurobiol. 53 (1), 344-354 (2016).
Rosczyk, H. A., Sparkman, N. L., Johnson, R. W. Neuroinflammation and cognitive function in aged mice following minor surgery. Exp Gerontol. 43 (9), 840-846 (2008).
Zhang, X., et al. Surgical incision-induced nociception causes cognitive impairment and reduction in synaptic NMDA receptor 2B in mice. J Neurosci. 33 (45), 17737-17748 (2013).
Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90-94 (2011).
Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nat Med. 20 (6), 659-663 (2014).
Smith, L. K., et al. beta2-microglobulin is a systemic pro-aging factor that impairs cognitive function and neurogenesis. Nat Med. 21 (8), 932-937 (2015).
Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
Sinha, M., et al. Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle. Science. 344 (6184), 649-652 (2014).
Castellano, J. M., et al. Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice. Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).

Etiketler

Orthopedic Surgery Parabiosis Postoperative Cognitive Dysfunction İmmünoloji Aging Trauma Multi-organ Dysfunction Regenerative Effects Cognitive Function Anesthesia Analgesia Surgical Procedure

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Xiong, C., Zhang, Z., Baht, G. S., Terrando, N. A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration. J. Vis. Exp. (132), e56701, doi:10.3791/56701 (2018).