Questo protocollo descrive un modello murino di chirurgia ortopedica che è stato usato per lo studio dei meccanismi di neuroinflammation postoperatoria e cambiamenti comportamentali e quando combinato con Parabiosi, per studiare la rigenerazione dei tessuti durante l’invecchiamento.
Chirurgia è usato comunemente per migliorare e mantenere la qualità della vita. Purtroppo, in pazienti vulnerabili come gli anziani, le complicazioni possono verificarsi e diminuire significativamente l’esito. Infatti, dopo intervento chirurgico ortopedico di routine per riparare una frattura, oltre il 50% dei pazienti anziani soffrono le complicazioni neurologiche come delirio. Inoltre, la capacità di guarire e rigenerare il tessuto dopo chirurgia diminuisce con l’età e possa influire sulla qualità della riparazione di frattura e anche osseous integrazione degli impianti. Così, una migliore comprensione dei meccanismi che guidano questi cambiamenti età-dipendenti potrebbe fornire obiettivi strategici per ridurre al minimo il rischio di tali complicanze e ottimizzare i risultati. Qui, presentiamo un modello murino clinicamente rilevanti di frattura tibia. I cambiamenti postoperatori in questi topi imitano alcuni dei danni conoscitivi osservati comunemente dopo intervento chirurgico ortopedico di routine in esseri umani. Brevemente, viene eseguita un’incisione nella destra dell’arto in condizioni strettamente asettiche. I muscoli sono dissociati, e un perno di 0,38 mm in acciaio inossidabile è inserito nella cresta superiore della tibia, all’interno del canale intramidollare. Osteotomia viene quindi eseguita, e la ferita viene cucita con punti metallici. Abbiamo utilizzato questo modello per studiare gli effetti del trauma chirurgico postoperatorio neuroinflammation e cambiamenti comportamentali. Applicando questo modello di frattura in combinazione con Parabiosi, un modello chirurgico in cui sono anastomosed 2 topi, abbiamo studiato le cellule e fattori secreti sistemica ringiovanire la rigenerazione di tessuto e la funzione dell’organo dopo la lesione. Seguendo il nostro protocollo di passo-passo, questi modelli possono essere riprodotti con la massima fedeltà e possono essere adattati per interrogare molte vie biologiche che sono alterate tramite il trauma chirurgico.
Chirurgia ha trasformato il sistema medico sanitario e continuamente sta contribuendo alla tecnologia d’avanguardia, sicurezza migliorata e mantenuto la qualità della vita. Purtroppo, chirurgia inoltre induce risposte patofisiologiche che possono portare a complicazioni postoperatorie compreso le infezioni della ferita, i danni neurologici e perfino la mortalità, specialmente in pazienti anziani1,2. Chirurgia ortopedica viene eseguita regolarmente, soprattutto in adulti più anziani, per migliorare la qualità della vita e riparare lesioni ossee comuni. Tuttavia, fino al 50% dei pazienti di chirurgia ortopedica che sono 65 anni e più vecchi esperienza menomazioni neurologiche quali delirio postoperatorio. Questo costantemente correla con la prognosi difficile, cioè, 5 volte aumento del rischio per la mortalità a 6 mesi, persistente declino funzionale, aumentato volta al paziente, una maggiore durata della degenza e tassi più alti di disposizione della casa di professione d’infermiera di professione d’infermiera 3 , 4 , 5. alcuni fattori di rischio, compreso l’età avanzata, sono state identificate, ma piccolo è conosciuto circa i meccanismi responsabili per i danni neurologici dopo la chirurgia.
Poiché le fratture sono molto comuni negli anziani, abbiamo stabilito un modello murino di frattura tibia per determinare l’impatto del trauma periferico il recupero postoperatorio, compreso neuroinflammation e cervello salute (funzione cognitiva)6, 7. questo modello, originariamente descritto da Harry et al. 8, composto da appuntare intramidollare e frattura tibia sotto anestesia e analgesia e quindi imita la pelle ferita, trauma muscolare, e osso riparazione associata a fratture di ossa lunghe comuni e riparare in esseri umani. Dopo questa procedura, topi dimostrano cambiamenti in indicatori infiammatori simili a cambiamenti osservati in esseri umani9,10, come pure l’attivazione microglial nell’ippocampo, che è associato con i deficit nella memoria dichiarativa e neuroplasticità hippocampal6,7,11. In precedenza abbiamo combinato questo modello di frattura con Parabiosi. Parabiosi sono un modello chirurgico in cui 2 topi sono anastomosed e quindi condividono un sistema circolatorio. Questo modello ha fornito un importante passo avanti nella comprensione di effetti regolatori di linfociti circolanti e fattori umorali sulla funzione dell’organo nel contesto dell’età e la malattia12,13,14. Utilizzando questo approccio abbiamo recentemente scoperto fattori sistemici associati con età-dipendente frattura guarigione12.
Qui, presentiamo un protocollo che unisce il modello di frattura tibiale con Parabiosi per lo studio dei meccanismi di età-dipendente dell’osso–cervello, che sono rilevanti per Neuroimmunologia e medicina rigenerativa. 1A di protocollo descrive la procedura di Parabiosi e dettagli del protocollo 1B la procedura di frattura tibiale (Figura 1A). Questi possono essere eseguiti in modo indipendente o in combinazione, a seconda della natura dell’interrogatorio.
Le fratture sono un problema clinico comune e rimangono delle cause principali di morbilità, specialmente nella popolazione senior in rapida crescita. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per un modello murino di frattura tibia per studiare i meccanismi responsabili di neuroinflammation postoperatoria e danno conoscitivo. Questo modello può essere combinato con chirurgia di Parabiosi per studiare interazioni neuro-immunitario, rigenerazione dei tessuti e altri processi di segnalazione. Capire questi meccanismi fornirà gli obiettivi strategici per ridurre al minimo i rischi di complicanze postoperatorie e ottimizzare i risultati.
Diversi modelli ortopedici sono stati sviluppati per studiare la riparazione ossea in roditori25. Abbiamo adottato e modificato questa procedura di frattura tibiale, originariamente descritta da Harry et al. 8, per studiare gli effetti della chirurgia ortopedica sulla funzione del cervello. Abbiamo anche usato questo modello di frattura in combinazione con il nostro modello di Parabiosi per studiare i fattori che sono responsabili di guarigione ossea e la rigenerazione tissutale di età-dipendente. Quando eseguito in anestesia generale volatile, questa procedura di frattura tibiale richiede solo circa 15 min per animale, risultati in zero alla minima mortalità (a seconda dell’età del mouse e della suscettibilità genetica sottostante) e ricapitola comune insulti associati con la frattura di ossa lunghe e trauma chirurgico ortopedico. Così, questo modello è ideale per interrogare le vie biologiche ed eseguendo valutazioni longitudinali. Tuttavia, è fondamentale che l’osteotomia e pinning sono riproducibili, e che il danno al tessuto molle è coerenza. Danni ai tessuti molli possono essere modulato, ad esempio da stripping il periostio e pizzicando i muscoli circostanti per rendere l’operazione più traumatica. Modelli di frattura traumatica indotta da trauma smussato non fissa o flessione su tre punti non fornirebbe tale coerenza o la precisione. Queste procedure sono spesso sfociano in re-ferita, che conduce alla risposta infiammatoria prolungata. Al contrario, i modelli di frattura che coinvolgono la fissazione rigida hanno un’infiammazione più moderata, che non completamente ricapitolare il danno connesso con ambulatorio ortopedico26,27.
Altri modelli che utilizzano il blocco di lega di titanio sono stati sviluppati per arthroplasty umana strettamente mimica e potrebbero essere più pertinenti per interrogare l’instabilità della protesi, osteolisi e complicazioni protesi-collegate in topi28,29 . Modelli di foro come quello presentato qui, fornire adeguata stabilizzazione, e topi possono essere testati in paradigmi comportamentali senza deficit significativi che potrebbero confondere tali attività come paura condizionata o aperto campo locomozione/ansia test6 ,7,11,15,19,20. Tuttavia, le deformità di rotazione possono verificarsi se la fissazione non è bloccata correttamente. Alcuni modelli utilizzano un fixator esterno, che fornisce la stabilizzazione superiore ma è difficile da implementare in una tibia di mouse, anche se può essere implementato con successo in un mouse femore27.
Disturbi cognitivi, tra cui delirio e disfunzione cognitiva postoperatoria, sono complicazioni comuni dopo chirurgia ortopedica per la riparazione di frattura, specialmente in pazienti anziani e fragili30. Questo modello di mouse clinicamente rilevanti della chirurgia per frattura tibiale dimostra che postoperatorio sistemica citochina rilascio6,7,17, alterata funzione barriera emato – encefalica15,19 e alterata morfologia microglial16,22, contribuiscono al danno di memoria e può rappresentare caratteristiche critiche delle complicazioni neurologiche postoperatorie vista in molti pazienti dopo chirurgia ortopedica. È importante notare che altre procedure chirurgiche sono state utilizzate per modellare la disfunzione cognitiva postoperatoria in topi. Questi includono addominale31,32,33 e chirurgia vascolare34 , come pure il trauma superficiale35,36. La tecnica di Parabiosi è applicabile a tutti questi modelli, che condividono i punti finali simili, tra cui l’infiammazione, l’attivazione gliale e deficit comportamentali, che può essere mediato da meccanismi comuni.
Gli studi che includono Parabiosi hanno rivelato nuovi ruoli per fattori circolanti che possono influire sulla funzione conoscitiva, neuroinflammation e ringiovanimento del tessuto in animali invecchiati37,38,39,40 ,41,42. Abbiamo dimostrato che Parabiosi possono essere combinati con successo con il modello di frattura tibiale descritto qui per interrogare percorsi rigenerativi e lo studio dei meccanismi che coinvolgono fattori ematica che influenza la guarigione e la frattura di riparazione12. Qui, abbiamo dimostrato che la capacità di riparazione di frattura di un animale invecchiato può essere ringiovanita quando l’animale invecchiato è anastomizzato ad un animale giovane. Questa inversione di età era radicata nell’attecchimento delle cellule ematopoietiche al luogo di frattura. È interessante notare che, tali ringiovanimento potrebbe essere ottenuta anche attraverso il trapianto di midollo osseo giovane in topi invecchiati. A questo proposito, trapianto di midollo osseo può essere considerato un approccio più diretto e semplice alternativo di Parabiosi. Tuttavia, Parabiosi sono un modello più robusto per indagare la funzione di linfociti circolanti e fattori. Ci aspettiamo che una combinazione di modelli di chirurgia ortopedica e Parabiosi giocherà un ruolo importante nel rispondere a domande critiche nel perioperatorio e biologia di invecchiamento.
In sintesi, vi presentiamo un protocollo dettagliato per un modello murino di frattura tibia per studiare i meccanismi responsabili di neuroinflammation postoperatorio ed il danno conoscitivo dopo le procedure chirurgiche ortopediche. Questo modello può essere combinato con una procedura di Parabiosi per studiare interazioni neuro-immunitario, rigenerazione tissutale e altre vie. Definizione di questi meccanismi fornirà gli obiettivi strategici per ridurre al minimo i rischi di complicanze postoperatorie e ottimizzare i risultati.
The authors have nothing to disclose.
Grazie Kathy Gage, BS (dipartimento di anestesiologia, centro medico della Duke University, Durham, NC) per assistenza editoriale. NT riconosce sostegno da una sovvenzione di innovazione di sogno da Duke anestesiologia e NIH/NIA R01 AG057525-01.
Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used |
Buprenorphine | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496- 6757-1 | Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | 70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning |
10% povidone Iodine | Dynarex | For antiseptic treatment of skin | |
SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | Low Flow Anesthesia system |
MouseSTAT | Kent Scientific | PS1161 | Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor |
Shaver | Wahl | 9854L | |
Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
Scalpel Handle | Fine science tools | 10003-12 | |
Scalpel Blades – #11 | Fine science tools | 10011-00 | |
Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | Needed for stripping the periosteum |
Iris Forceps | Fine science tools | 11066-07 | Useful (1×2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma |
Bonn Scissors (Straight) | Fine science tools | 14084-08 | Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt |
Fine Scissors | Fine science tools | 14058-09 | Sharp scissors for cutting sutures |
22G x 3.5 In Quincke Spinal Needle | BD | 405181 | Use inner rod for pinning |
Needle Holders | Fine science tools | 12001-13 | |
Suture | Look | 1079B | |
C57BL6/J | Jackson Laboratory | stock no. 000664 | |
eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously) | Jackson Laboratory | stock no. 003291 |