Мы представляем в vivo imaging метод с использованием двух разных флуоресцентных красителей для отслеживания динамических позвоночника сосудистых изменений после тупыми спинного мозга у взрослых крыс Sprague-Dawley.
Травмы спинного мозга (SCI) вызывает значительные сосудистые нарушения на месте травмы. Сосудистая патология возникает сразу же после SCI и продолжается на протяжении всего этапа острой травмы. В самом деле эндотелиальные клетки, как представляется, быть первым, чтобы умереть после тупыми SCI. Начале сосудистых событий, включая повышение проницаемости барьер крови-спинного мозга (BSCB), вызвать отек vasogenic и способствовать события пагубных вторичных повреждений, вызванных сложные повреждения механизмов. Таким образом, ориентация сосудистые нарушения, может быть ключевой стратегией по сокращению вторичных повреждений каскадов, которые способствуют гистологические и функциональные расстройства после SCI. Предыдущие исследования проводились главным образом на посмертный образцов и не смогли захватить динамические изменения сосудистой сети. В этом исследовании мы разработали в vivo дуэт цвет 2 Фотон изображений метод мониторинга острой сосудистой динамических изменений, после тупыми SCI. Этот подход позволяет определять поток крови, диаметр судна и других сосудистых патологий на различных участках же крысы до и после травмы. В целом этот метод обеспечивает отличное место для изучения сосудистой динамики.
Травматические спинного мозга (SCI) является общей травмы, ведущих к ухудшению моторные, сенсорные и автономной функции. Согласно национальной спинного мозга травмы статистический центр (NSCISC) в 2016 году, примерно 282,000 человек пострадали в то время как 69% из них были главным образом вследствие дорожно-транспортных происшествий или падает1. Эти пациенты часто требуют интенсивной терапии; Однако в настоящее время доступен без эффективного лечения. Поэтому срочно необходимы новые эффективные стратегии к SCI.
SCI главным образом делится на две фазы: первичной травма и вторичные травмы. Основной вред включает физическое оскорбление, вызывая геморрагические некроз в месте воздействия2, последовал ряд вторичных повреждений событий, таких как воспаление, апоптоз клеток и демиелинизации оставшихся аксонов, которые постепенно привести для расширения Морфологические и функциональные дефициты3,4,5,6. Кровотечение является первый видимый знак травмы, указывающее немедленное сосудистые нарушения в острой фазе SCI7,8. Нейропротекторной стратегии, направленной на сокращение раннего сосудистое повреждение может улучшить восстановление пациентов, но это требует лучшего понимания патофизиологические механизма раннего сосудистых событий после травмы.
Несмотря на предыдущие исследования с использованием различных методов для изучения позвоночника сосудистую остаются значительные ограничения. Наиболее общий недостаток изучает только посмертных образцы, например, водорода Распродажа9, радиоавтография10, microangiogram8, сосудистой коррозии слепки11и иммуногистохимия12 ,13. Хотя и обеспечивает Лазерная доплеровская флоуметрия Неинвазивный мониторинг спинного мозга крови поток14в реальном времени, он не может различать сосудистых систем и выявления сосудистых морфологические изменения. Динамический контраст расширение МРТ (DCE-МРТ) также является неинвазивным, но она создает изображения с низким разрешением и требует дорогостоящей инфраструктуры15.
Хотя в vivo imaging с помощью 2-Фотон лазерная сканирующая микроскопия (2 P-LSM) был разработан для изучения vasodynamics в коре16,17,18, имеют ограниченное количество исследований продемонстрировали сосудистые изменения после SCI. Тан et al. показали изменения в поток крови на крае поражения сайта в гемисекция модель19, но изображений после тупыми травмы является более сложным по двум причинам. Во-первых традиционное стекло оптическое окно над места повреждения не будет поддерживать механического воздействия и оставаться функциональным для воображения. Во-вторых, утечки трассировщика в паренхиме из-за кровотечения создает трудности с работой с образами после травмы.
Здесь мы представляем романа дуэт цвет изображения метод, который позволяет изображений же отдельных судов на этапах до и после травмы времени. Кроме того он обеспечивает временной и пространственный профиль сосудистых динамических изменений после тупыми SCI. Она также имеет потенциал для обработки изображений в нескольких точках время после травмы. Этот протокол может применяться непосредственно к трансгенных животных для изучения взаимодействия нервно-сосудистых.
Одна из задач для сосудистых исследований после SCI является техническое ограничение потому, что традиционные методы во многом ограничены изменения сосудистой структуры в посмертных образцы. Этот роман в vivo imaging описанным выше способом обеспечивает динамическое измерение потока крови и связанных параметров (скорость и судно диаметр) с помощью 2 P-LSM в живой крысы. Она также позволяет повторный экзамен в одинаковых сосудов в разное время точках после тупыми SCI. Предыдущие методы визуализации 2-Фотон микроскопии смогли захватить посттравматической сосудистых структур из-за утечки трассирующими одного. Наш дуэт цвет дизайн позволяет динамической сосудистой изображений для травматического моделей. Кроме того гибкость этого метода обеспечивает возможность создания временной и пространственный профиль острых сосудистых изменений, после SCI.
Есть несколько важных шагов в нашей в vivo дуэт цвет изображений методом. Во-первых она имеет основополагающее значение для обеспечения физической стабильности спинного мозга до замедленной изображений, особенно уменьшение дыхательные движения артефакт. Мы разработали форму позвоночника зажимы слегка поднять высоту спинной позвонок во время стабилизации. Таким образом движение спинного корреляции для дыхания животных может быть значительно снижается (рис. 1 d-F, 2B). Рекомендуется для проверки стабильности спинного мозга до начала каждой сессии изображений. Если спинной мозг не удается добиться стабильности, произвести корректировку для выравнивания и герметичности спинного зажимы. Во-вторых, периферических тканей (кости, слой мышц и кожи) кровотечение в окно визуализации может рисков загрязнения представления. Для сеанса гладкой изображений gelfoam и ткань клей клей следует применять на окружающие ткани для эффективной профилактики. В-третьих флуоресцентных красителей, которые мы выбираем имеют аналогичного размера как альбумин (66 кДа), который является белком плазмы крови основные высокой молекулярной массой. Гомеостатических условиях красители были во многом сохранил внутри судна, аналогичные как альбумин28. После травмы красители прошли через нарушается структура эндотелия и утечка в паренхиме, вызывая значительное увеличение интенсивности флуоресценции в периферийной зоне сосудистую (Рисунок 3F-G). Кроме того есть две причины, почему мы выбираем внешний яремной катетеризации. Во-первых она может обеспечить неизменно доступной маршрут доставки в любое время эксперимента. Во-вторых она может использоваться как маршрут для будущей лечения инъекций.
Хотя наш дуэт цвет в vivo метод способен обеспечить Роман место для визуализации сосудистой травматического, должна решаться некоторые оговорки относительно этой техники. В настоящее время этот метод предназначен для оценки сосудистых изменений 2 момента времени (базовый и 1 очко после травмы времени), но это возможно переключиться на несколько моментов времени, если доступны дополнительные флуоресцентных красителей и каналы. Хотя есть несколько исследований, с использованием имплантированных стекла для хронической прижизненной визуализации, никто из них не может предоставить базовую информацию на том же судне после травматического повреждения19,,2930, 31,32. В отличие от этих исследований наши окно является окном без стекла. Это удобно для изображений до и после травмы, но это может быть сложным для восстановления окна для долгосрочного наблюдения. Наши будущие исследования работает над технического усовершенствования для хронических воображения. Сосудистой системы состоит из нескольких типов судов (артерии, вен и капилляров), и каждый отличается в аспектах морфологии и функции. Дифференциация среди типов судов во время визуализации может помочь дразнить из четкая схема сосудистых изменений. Протокол выше, зависит от наблюдателя, идентификации судов, основанный на словотолковании и скорости; Однако артерии конкретных краситель могут добавляться легко дать более точные классификации между судно типа33.
Этот метод является не только ограничивается оценок на тупыми и других травматических модели, такие как раздавить травм и травм излучения, но и на исследования, посвященные нарушению BSCB, а также сосудистой проницаемости изменения. Кроме того SCI он может использоваться для изучения сосудистые изменения после других нейродегенеративных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS) и рассеянный склероз (РС). Кроме того это может быть передаваемой трансгенных животных модель для изучения динамических нейроваскулярных взаимодействия. Как инструмент мощный скрининга будущие исследования могли бы использовать изображений техники, описанную здесь, для оценки эффективности лечения травмы спинного мозга.
В заключение в естественных условиях дуэт цветной метод является надежной, в реальном времени, в естественных условиях подход инструмент для оценки динамических сосудистых изменений, которые идеально подходит для характеризации временных и пространственных сосудистой профиля и скрининга для лечения снижению вторичного ущерба после SCI.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа частично поддержали низ NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, заслуги обзор премии I01 BX002356 от Департамента по делам ветеранов США, Крейг H Neilsen фонд 296749, Индиана спинного и головного мозга травмы исследовательский фонд ( ISCBIRF) Индиана государственный департамент здравоохранения (019919), и Мари Hulman Джордж Дотационного фонды.
Purdue Products Betadine Surgical Scrub | Fisher Scientific | 19-027132 | Skin sterilization |
Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) | Patterson Veterinary | 07-881-9413, 07-890-5745 | Anesthetic agent |
Buprenorphine(0.03 mg/mL) | Patterson Veterinary | 07-891-9756 | Pain relief agent |
Carprofen | Patterson Veterinary | 07-844-7425 | Non-steroidal anti-inflammatory drug |
Dukal Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-490 | Skin sterilization |
Decon Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | 04-355-450 | Skin sterilization |
Artificial Tears Eye Ointment | Webster Veterinary | 07-870-5261 | Prevent drying eyes |
Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 1006015 | |
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average mol wt 70kDa |
Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | Average mol wt 70kDa |
Instrument Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | for sterilizing surgery tool |
Spine stabilizer set | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
Vetbond | 3M Animal Care Products | 1469SB | Tissue adhesive Glue |
Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | Stop bleeding |
Noyes Spring Scissors | F.S.T | 15013-12 | |
Fine Forceps- Dumont #5 | F.S.T | 11254-20 | |
Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | laminectomy |
Surgical Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | skin cut |
Scalpel Blade #15 | Royal-Tek | BS2982 | skin cut |
micro angled scissors | World Precision Instruments | 500260 | Can be from any vendor |
3-0 vicryl sutures | Ethicon | J393H | Can be from any vendor |
1ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200.V0 | Can be from any vendor |
21 gauge needle | BD | 305165 | Can be from any vendor |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Can be from any vendor |
Two-photon Laser Scanning Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | ||
LISA device | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
HCImage Live | Hamamatsu Corporation | Imaging software | |
PrairieView | Prairie Technologies/Bruker | Two-photon imaging software | |
ImageJ | Image analysis software | ||
Matlab statistics toolbox | The MathWorks, Inc. | https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle | Image analysis software |