Um Vivo em Método de dupla-cor de imagem dinâmica Vascular após lesão da medula espinhal Contusive

Todos os procedimentos de manipulação cirúrgica e animais foram realizados conforme aprovado sob o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório (National Research Council) e as diretrizes da Indiana University School de medicina institucional Cuidado Animal e uso Comitê. 1. Preparação cirúrgica Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo o estabilizador da coluna vertebral. Limpe a mesa de cirurgia e toda a área circundante com etanol a 70%. Para a preparação do procedimento cirúrgico não-sobrevivência, coloque uma almofada de limpeza cirúrgica na parte superior a 37 ° C almofada de aquecimento. Use seis semanas de idade ratos Sprague Dawley (SD) para este estudo. Pesar e anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal de cetamina (87,7 mg/kg) e mistura de xilazina (12,3 mg/kg). Confirme o estágio apropriado de anestesia quando o animal deixa de responder a um estímulo de pitada de dedo do pé. Injectar por via subcutânea 0,01-0,05 mg/kg de buprenorfina e carprofeno a 5mg/kg antes da cirurgia. Raspar o rato em 2 áreas: região da coluna cervical nas costas e a região do pescoço do lado materno. Esfregue as áreas de pele com esfoliação cirúrgica de betadine e toalhetes com álcool 70%. Aplica a pomada para evitar o olho seco durante a cirurgia. Coloque o animal na posição supina sobre a almofada de limpeza cirúrgica. 2. cateterização da Veia Jugular externa Localizar a veia jugular externa, encontrando o ponto de pulso perto da clavícula e cortar com uma tesoura pequena Primavera para fazer uma incisão vertical no local, que é o ponto de Cruz de 3 pontos anatômicos: caudal ramus da mandíbula direita, tubérculo maior do úmero e manúbrio (figura 1A). Isole o vaso utilizando a mola tesoura e pinça fina. Amarre a extremidade distal com 1 esterilizados para suturas cirúrgicas linha (Figura 1)20. Prepare uma seringa de 1 mL, preenchido com solução salina e conectados com um cateter especializado feito de uma agulha de calibre 21 (figura 1B). Faça uma pequena incisão usando um par de tesouras micro no navio e deslize o cateter dentro do vaso. Fixe a agulha amarrando ambos proximal e distal final (Figura 1). O cateter especializado é feito com uma agulha calibre 21. Moer a ponta plana e solda com um pedaço de 2 mm da ponta cortada da outra agulha 21. Isto pode prevenir o cateter de passar lá fora. Nota: Uma pequena quantidade de sangue que flui para a agulha indica que a agulha entrou com sucesso um vaso sanguíneo. 3. espinha estabilização e laminectomia de C5-C7 Coloque o animal em posição. Corte a pele ao longo da linha mediana com uma lâmina de bisturi n º 15, na altura da coluna desejada. Disse as camadas de músculo de 5th para 7th vértebras cervicais (C5-C7) bilateralmente para expor as facetas lateral (Figura 2A)21. Nota: Localize a segunda vértebra torácica (T2), encontrando o pico entre as escápulas. Contagem para cima a partir da vértebra T2 para encontrar o C7 vértebra21,22,23,24. Estabilize a coluna do rato utilizando um aparelho de estabilização modificado. Faça um corte em ambos os lados do osso vertebral lateral. Mova os braços de aço inoxidável sob as facetas exposto processo transverso e aperte os parafusos para garantir a estabilidade (Figura 2B). Remova cuidadosamente as lâminas de C5-C7 (laminectomia, Figura 2). Coloque um pedaço pequeno de gelfoam soro fisiológico embebido em cima da dura-máter exposta para mantê-la hidratada (Figura 2D). 4. instalação de janela de imagem dois fotões (2P) Pequenos pedaços de material de gelfoam a na lacuna entre os músculos e ossos vertebrais, também coisas uma linha fina de gelfoam entre ossos vertebrais e medula espinhal, em seguida, use cola adesiva de tecido para selar a área de músculo-osso circundante. Espere 5 min. para secagem completa (Figura 2E). Nota: Esta etapa impede eficazmente o futuro sangrando na janela e leakiness de soluções de imersão. Prepare-se 4% de ágar com DDQ2O no microondas. Após o ágar é dissolvido completamente, espere até que ele retorne a uma temperatura touchable. Encher uma seringa estéril de 1 mL com solução de ágar e canalizá-lo para a borda da janela para construir um muro (Figura 2E). A solução se solidifica rapidamente e permanece flexível para permitir que a lente ou objectivo mover-se livremente. Quando estiver pronto para a imagem latente, remova o fluido de imersão gelfoam e lugar dentro da janela para 2P (Figura 2F) de imagem. Transfira o animal estabilizado dentro da câmara escura 2-fóton microscópio e a janela de imagem 2P diretamente sob a lente. Baixe a lente cuidadosamente dentro da janela de imagem. 5. injeção de primeiro corante fluorescente e imagens da linha de base Preparar 0,5 mL de rodamina B isotiocianato-dextrano (peso molecular médio de 4 mg/mL ~ 70kDa) em solução salina. Encher uma seringa estéril de 1 mL com a solução e conecte a seringa de cateter instalado anteriormente. Nota: Preparar a solução de tintura fluorescente antes de que recomenda-se usar. Injetar o primeiro corante pressionando-se a seringa lentamente (Figura 3B). Primeiro, use a ocular para identificar a área de interesse. Use uma câmera do dispositivo acoplado (CCD) de carga para adquirir uma imagem brilhante-campo dos padrões dos vasos sanguíneos superficiais em menor ampliação como uma imagem de Marco. Alterne para o modo de digitalização laser abrir o 2P imaging software para coletar as duas imagens e linha-verificação de dados. Selecione o comprimento de onda da excitação de laser de adequada 2P, poder e fluorescente canal (canal vermelho para primeiro corante) para combinar com o fluorophores usado no tecido imagem e execute na vivo de imagem (Figura 3E). Manter o animal em uma almofada de aquecimento durante todo o processo. 6. C7 Contusive lesão usando dispositivo LISA Execute uma lesão contusão na linha mediana C7 usando um dispositivo de Louisville lesão sistema aparelhos (LISA) de acordo com um protocolo previamente estabelecido25,26. Em breve, coloca o animal no palco LISA após a calibração.Depois de selecionar um ajuste do ponto zero e ajustando o tecido deslocamento (0,800 mm neste caso), clique no botão de “Executar o experimento” do software para desencadear a liberação de pêndulo e criar o prejuízo. Após a lesão, coloque outro pedaço pequeno de gelfoam soro fisiológico embebido em cima da dura-máter exposta para mantê-la hidratada. Repita a etapa 4.3 e re-executar a imagem latente na vivo na mesma área visível com o corante vermelho injetado anteriormente (Figura 3 & F). Transferir a animal de volta para a mesa cirúrgica e manter o animal sedado com anestesia adequada, seguindo o protocolo IACUC-Importantíssima. 7. injeção do segundo corante fluorescente e pós-lesão Imaging Preparar 0,5 mL de isotiocianato de fluoresceína-dextrano (4 mg/mL, peso molecular médio ~ 70 kDa) em solução salina como 5.1. Encher uma seringa estéril de 1 mL da solução e se conectar com o cateter instalado anteriormente. Transferir parte traseira animal estabilizada dentro da câmara escura de microscópio 2P e refazer a imagem da mesma área com o canal vermelho para o primeiro corante e o canal verde para o segundo corante (figuras 3D & G). No final da imagem, solte o rato do dispositivo de estabilização da coluna vertebral e limpar a parede de ágar. 8. animal sacrifício Depois da imagem latente, sacrifica o rato a perfusão de transcardial protocolo27a seguir. Coletar as amostras de medula espinhal e fixar os 4% PFA. 9. análise de dados offline: Quantificação de diâmetros de navio Transferi os arquivos de imagem para uma estação de trabalho para análise off-line. Abra ImageJ e selecione “arquivo” e escolher anteriormente salvo dados brutos e abra o arquivo de imagem única associada (Figura 4B). Calibre a imagem selecionando “Analisar” seguido por “Definir escala” (Figura 4). O valor colocado na “Distância em pixels” é calculado usando a equação exibida na Figura 4A. A calibração de lente ótica 2-fóton determina o valor padrão na equação. O valor de “opticalZoom” é encontrado em Excel Extensible Markup Languagefile (arquivo XML) associado com o arquivo de imagem única (Figura 4B). Desenhar uma linha perpendicular ao eixo longo do navio (Figura 41 & E1) e selecione “Analisar” seguido por “Medida”. A medição do diâmetro do vaso é exibida na janela de resultados (Figura 42 & E2). Repeti 3 vezes do outro lado do navio para adquirir o valor médio. 10. offline análise de dados: Quantificação de vermelho sangue (RBC) velocidade de célula Transferi os arquivos de verificação de linha na estação de trabalho para análise. Iniciar o software ImageJ e selecione “arquivo” e depois escolher anteriormente salvo dados brutos e abrir todos os arquivos de verificação de linha associado com o nome de extensão “.ome”. Abra a “Imagem” e selecione “Stacks” seguidos por “imagens a pilha”. Converta todos os arquivos OME em um único pilha TIFF arquivo de imagem. Iniciar o software Matlab e clique em “Abrir”, selecione o arquivo de código “LSPIV_parallel.m”. Nota: O código de Matlab para LS-PIV pode ser baixado em https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18 Selecione as seguintes ordens: “Executar” > “Alterar pasta” > “artéria”. Escolha o arquivo TIFF de pilha de imagem gerado em 10.3. Digite “Y” e pressione Enter. Coloque um cursor à esquerda e à direita da imagem, respectivamente, e o programa começa a processar os dados. No final do programa, insira 2 valores para calcular a leitura final: “valor de conversão de pixel_meter” e “valor de conversão de tempo de varredura”. Ambos encontram-se no arquivo XML associado com linha-verificação dados. O valor final é expresso como a média e o desvio padrão da velocidade nas unidades de milímetro por segundo (mm/s).