Vivo דואו-צבע שיטת הדמיה Dynamics כלי הדם בעקבות פגיעה בחוט השדרה Contusive
Özet
אנחנו מציגים של ויוו הדמיה השיטה באמצעות שני צבעי פלורסנט שונים כדי לעקוב אחר שינויים דינמיים בעמוד השדרה כלי הדם בעקבות פגיעה בחוט השדרה contusive בחולדות ספראג-Dawley למבוגרים.
Abstract
פגיעה בחוט השדרה (SCI) גורם הפרעה וסקולרית משמעותי באתר של פציעה. פתולוגיה וסקולרית יתרחש מיד אחרי SCI וממשיך לאורך כל השלב פגיעה חריפה. למעשה, תאי אנדותל להיראות הראשון למות לאחר הפוליטיקה contusive האירועים כלי דם מוקדם, כולל חדירות מוגברת של המכשול דם-עמוד השדרה (BSCB), זירוז vasogenic בצקת ולתרום פוגעת פגיעה משנית אירועים הנגרם על ידי מנגנוני פגיעה מורכבים. פילוח של הפרעה וסקולרית, לכן, יכול להיות אסטרטגיה המפתח לצמצום פגיעה משנית cascades שתורמים ליקויי היסטולוגית ופונקציונליים לאחר לביוטכנולוגיה מחקרים קודמים שבוצעו בעיקר על דגימות לאחר המוות, הצליחו ללכוד את השינויים הדינמיים של רשת כלי הדם. במחקר זה, פיתחנו ויוו דואו-צבע שני הפוטונים הדמיה שיטה כדי לעקוב אחר השינויים דינמי כלי דם אקוטי בעקבות לביוטכנולוגיה contusive גישה זו מאפשרת זיהוי זרימת הדם קוטר הכלי, אחרים כלי הדם פתולוגיות באתרים שונים של העכברוש אותו מראש, לאחר פציעה. בסך הכל, שיטה זו מספקת מקום מצוין עבור חוקרים dynamics כלי הדם.
Introduction
פגיעה בחוט השדרה טראומטי (SCI) היא פגיעה נפוצה המוביל ליקוי של הפונקציה מוטורית, חושית, אוטונומיות. על פי נבחרת חוט השדרה פציעה סטטיסטי מרכז (NSCISC) 2016, כ 282,000 אנשים נפגעו בזמן 69% מהם היו בעיקר עקב תאונות או נופל1. חולים אלו דורשים טיפול נמרץ; עם זאת, אין טיפול יעיל זמין כעת. לכן, אסטרטגיות אפקטיביות חדשות לקראת SCI נחוצים בדחיפות.
SCI בעיקר מחולק לשני שלבים: ראשי פגיעה ופציעה משנית. הפגיעה העיקרית כוללת את העלבון הפיזי הגורם לנמק hemorrhagic באתר של ההשפעה2, ואחריו סדרה של אירועים פציעות משניות, כגון דלקת, אפופטוזיס תא demyelination של אקסונים הנותרים, שיובילו בהדרגה אל ההרחבה של גירעונות פונקציונלי מורפולוגיים3,4,5,6. דימום הוא סימן נראה לעין הראשונה של פגיעה, המציין של הפרעה וסקולרית מיידית בשלב אקוטי של SCI7,8. אסטרטגיה neuroprotective שמטרתו להפחית את הנזק לכלי הדם מוקדם יכול לשפר את ההתאוששות של חולים, אבל זה דורש הבנה טובה יותר של מנגנון pathophysiological האירועים כלי הדם לאחר פציעה מוקדמת.
למרות שמחקרים קודמים בשיטות שונות כדי ללמוד להערכת חוט השדרה, נותרו מגבלות משמעותיות. החיסרון הכי המשותף הוא לומד רק לאחר המוות דגימות, למשל, מימן סיווג9, autoradiography10, microangiogram8, קורוזיה וסקולרית הטלות11ו אימונוהיסטוכימיה12 ,13. למרות Flowmetry דופלר לייזר מספקת ניטור בזמן אמת לא פולשנית של זרימת הדם חוט השדרה14, הוא מסוגל להבדיל בין מערכות כלי הדם ולגלות שינויים מורפולוגיים כלי הדם. MRI משופרת ניגודיות דינמי (DCE-MRI) היא גם לא פולשנית, אבל זה יוצר תמונות ברזולוציה נמוכה ודורש של תשתית יקר15.
למרות ויוו הדמיה באמצעות 2-פוטון לייזר מיקרוסקופ סריקה (2, P-LSM) פותחה ללמוד vasodynamics בקליפת17,16,, או18, יש מספר מצומצם של מחקרים שינויים בכלי הדם הפגינו בעקבות טאנג לביוטכנולוגיה ואח הראו שינויים בזרימת הדם בקצה האתר הנגע דגם hemisection19, אבל הדמיה לאחר פציעה contusive מאתגרת יותר משתי סיבות. ראשית, חלון זכוכית המסורתית אופטי מעל אתר הפגיעה לא לקיים את ההשפעה מכני, נותרים פונקציונליים עבור הדמיה. שנית, דליפת מעקב אל parenchyma עקב דימום יוצר קושי עם הדמיה לאחר פציעה.
כאן אנו מציגים שיטת הדמיה duo הרומן-צבע, המאפשרת הדמיה אותם כלי-דם בודדים בנקודות זמן מראש, לאחר פציעה. בנוסף, הוא מספק פרופיל זמני מרחבי של כלי הדם שינויים דינמיים בעקבות של הפוליטיקה contusive יש גם את הפוטנציאל עבור הדמיה בנקודות זמן שלאחר פציעות מרובות. פרוטוקול זה ניתן להחיל ישירות לבעלי מהונדס ללמוד נוירו-וסקולריים אינטראקציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אתגר אחד ללימודי כלי הדם בעקבות SCI היא המגבלה הטכנית בטכניקות מסורתיות מוגבלים בעיקר שינויים במבנה כלי הדם בדגימות לאחר המוות. רומן זה ויוו הדמיה השיטה המתוארת לעיל מאפשר מדידה דינאמית של זרימת הדם ופרמטרים הקשורים (מהירות, כלי קוטר) באמצעות 2, P-LSM בחולדות בשידור חי. זה גם מאפשר בדיקה חוזרת ונשנית בערכות באותו כלי בנקודות זמן שונות בעקבות לביוטכנולוגיה contusive טכניקות הדמיה 2-פוטון מיקרוסקופ הקודם הצליחו ללכוד פוסט-טראומה מבנים כלי הדם עקב דליפת מכשיר מעקב יחיד. העיצוב שלנו דואו-צבע מאפשר דימות כלי הדם דינמי לדגמי טראומטי. בנוסף, הגמישות של שיטה זו מספקת הזדמנות ליצור פרופיל המרחבית-טמפורלית מהשינויים כלי דם אקוטי בעקבות לביוטכנולוגיה
ישנם מספר שלבים קריטיים בשיטה שלנו ב- vivo דואו-צבע דימות. קודם כל, זה היסוד כדי להבטיח את יציבות עמוד השדרה לפני זמן לשגות דימות, ובמיוחד צמצום נשימה תנועה החפץ הפיזי. תיכננו את צורת מלחציים בעמוד השדרה כדי להעלות את הגובה של חוליית עמוד השדרה קלות במהלך מייצב. וכך התנועה של חוט השדרה מתאם לחיה נשימה יכולה להיות הקטנו (איור 1D-F, 2B). מומלץ לבדוק את יציבות עמוד השדרה לפני תחילתו של כל מפגש הדמיה. אם חוט השדרה לא מצליח להשיג יציבות, ההתאמה צריכה להיעשות יישור ו ההידוק של חוט השדרה מלחציים. השני, היקפי רקמה (עצם, שכבת השריר והעור) דימום לתוך חלון הדמיה עלולות לסכן. זיהום של התצוגה. עבור הפעלת הדמיה חלקה, השאיבה ורקמות דבק דבק צריך להיות מוחל על הרקמה שמסביב למניעת יעיל. שלישית, צבעי פלורסנט שאנו בוחרים להיות בגודל דומה אלבומין (66 kDa), אשר הוא החלבון העיקרי משקל מולקולרי גבוה פלזמה דם. בתנאים homeostatic, הצבעים נשמרו במידה רבה בתוך הכלי דומה כמו אלבומין28. אחרי הפציעה, הצבעים עבר המבנה אנדותל קטועים, דלף אל parenchyma, גורם בעוצמה משמעותית של פלורסנט מוגברת באזור הפריפריה להערכת (איור 3F-G). בנוסף, ישנן שתי סיבות למה בחרנו צנתור עורק הצוואר. קודם כל, זה יכול לספק מסלול נגיש באופן עקבי של משלוח בכל עת של הניסוי. שנית, זה יכול לשמש מסלול להזרקה טיפול בעתיד.
למרות ויוו דואו-צבע השיטה שלנו מסוגל לספק מקום הרומן ללימודי טראומטי דימות כלי דם, כמה אזהרות לגבי טכניקה זו יש להתייחס. כיום, טכניקה זו נועד להעריך שינויים בכלי הדם 2 נקודות זמן (בסיסית ו- 1 נקודה זמן לאחר פציעה), אבל זה אפשרי לעבור מספר נקודות זמן אם צבעי פלורסנט נוספים וערוצים זמינים. למרות שיש מספר מחקרים באמצעות חלון זכוכית מושתל עבור הדמיה intravital כרונית, אף אחד מהם לא יכול לספק מידע בסיסי על אותו כלי השיט לאחר פציעה טראומטית19,29,30, 31,32. בניגוד מחקרים אלו, החלון הוא חלון זכוכית-לא. זה נוח עבור הדמיה מראש, לאחר פציעה, אבל זה יכול להיות מאתגר להקמת מחדש את החלון להשגחה לטווח ארוך. המחקר העתידי שלנו עובד על שיפור טכני עבור הדמיה כרונית. מערכת כלי הדם מורכב של מספר סוגים של כלי השיט (עורק, וריד ונים) וכל אחד שונה בהיבטים של מורפולוגיה ותפקוד. הבחנה בין סוגי כלי השיט במהלך ההדמיה יכולה לעזור להתגרות דפוס ברור של שינויים בכלי הדם. הפרוטוקול הנ ל תלוי המתבונן זיהוי כלי מבוסס על מורפולוגיה והמהירות; עם זאת, צבע ספציפי עורק ניתן להוסיף בקלות לתת סיווג מוחלטים יותר בין סוגי כלי השיט33.
טכניקה זו היא לא רק מוגבלת כדי הערכות על contusive, מודלים טראומטיים אחרים, כגון פציעה למחוץ ופציעה קרינה, אבל גם על לימודי התמקדות שיבוש BSCB, חדירות באותה מידה כמו כלי הדם משתנה. מלבד SCI, זה יכול לשמש כדי לחקור את השינויים בכלי הדם בעקבות מחלות ניווניות אחרות כגון נוירודגנרטיביות (ALS), טרשת נפוצה (MS). יתר על כן, יתכן להעברה למודל בעלי חיים הטרנסגניים את האינטראקציה דינמי נוירו-וסקולריים. ככלי מיון רב עוצמה, מחקרים עתידיים יכול לנצל את טכניקת דימות המתוארים כאן כדי להעריך את היעילות של הטיפול עבור פגיעה בחוט השדרה.
לסיכום, אין ויוו דואו-צבע שיטה הוא כלי הגישה אמין, בזמן אמת, אין ויוו הערכת דינמי שינויים בכלי הדם, אשר הינו אידיאלי עבור אפיון פרופיל וסקולרית מרחבית-טמפורלית, הקרנת עבור טיפולים לצמצם נזקים משניים בעקבות לביוטכנולוגיה
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי NIH NS059622, NS073636, משרד ההגנה CDMRP W81XWH-12-1-0562, ערך סקירה פרס I01 BX002356 מן ארה ב המחלקה לענייני חיילים משוחררים, קרייג H Neilsen קרן 296749, חוט השדרה אינדיאנה (קרן מחקר פגיעה במוח ISCBIRF) של מחלקת המדינה אינדיאנה הבריאות (019919), מארי. ג’ורג ‘ Hulman הקרן כספים.
Materials
| Purdue Products Betadine Surgical Scrub | Fisher Scientific | 19-027132 | Skin sterilization |
| Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) | Patterson Veterinary | 07-881-9413, 07-890-5745 | Anesthetic agent |
| Buprenorphine(0.03 mg/mL) | Patterson Veterinary | 07-891-9756 | Pain relief agent |
| Carprofen | Patterson Veterinary | 07-844-7425 | Non-steroidal anti-inflammatory drug |
| Dukal Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-490 | Skin sterilization |
| Decon Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | 04-355-450 | Skin sterilization |
| Artificial Tears Eye Ointment | Webster Veterinary | 07-870-5261 | Prevent drying eyes |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 1006015 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average mol wt 70kDa |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | Average mol wt 70kDa |
| Instrument Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | for sterilizing surgery tool |
| Spine stabilizer set | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Vetbond | 3M Animal Care Products | 1469SB | Tissue adhesive Glue |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | Stop bleeding |
| Noyes Spring Scissors | F.S.T | 15013-12 | |
| Fine Forceps- Dumont #5 | F.S.T | 11254-20 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | laminectomy |
| Surgical Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | skin cut |
| Scalpel Blade #15 | Royal-Tek | BS2982 | skin cut |
| micro angled scissors | World Precision Instruments | 500260 | Can be from any vendor |
| 3-0 vicryl sutures | Ethicon | J393H | Can be from any vendor |
| 1ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200.V0 | Can be from any vendor |
| 21 gauge needle | BD | 305165 | Can be from any vendor |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Can be from any vendor |
| Two-photon Laser Scanning Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | ||
| LISA device | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Corporation | Imaging software | |
| PrairieView | Prairie Technologies/Bruker | Two-photon imaging software | |
| ImageJ | Image analysis software | ||
| Matlab statistics toolbox | The MathWorks, Inc. | https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle | Image analysis software |
Referanslar
- National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet 2016. , (2016).
- Dumont, R. J., et al. Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms. Clin Neuropharmacol. 24 (5), 254-264 (2001).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- Liu, N. K., et al. A novel role of phospholipase A2 in mediating spinal cord secondary injury. Ann Neurol. 59 (4), 606-619 (2006).
- Wu, X., Xu, X. M. RhoA/Rho kinase in spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (1), 23-27 (2016).
- Li, X. G., et al. Combination of methylprednisolone and rosiglitazone promotes recovery of neurological function after spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (10), 1678-1684 (2016).
- Kulkarni, M. V., et al. Acute spinal cord injury: MR imaging at 1.5. T. Radiology. 164 (3), 837-843 (1987).
- Tator, C. H., Koyanagi, I. Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal cord injury. J Neurosurg. 86 (3), 483-492 (1997).
- Kobrine, A. I., Doyle, T. F., Martins, A. N. Spinal cord blood flow in the rhesus monkey by the hydrogen clearance method. Surg Neurol. 2 (3), 197-200 (1974).
- Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
- Koyanagi, I., Tator, C. H., Theriault, E. Silicone rubber microangiography of acute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 32 (2), 260-268 (1993).
- Noble, L. J., Wrathall, J. R. Correlative analyses of lesion development and functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat. Exp Neurol. 103 (1), 34-40 (1989).
- Maikos, J. T., Shreiber, D. I. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due to mechanical trauma. J Neurotrauma. 24 (3), 492-507 (2007).
- Tei, R., Kaido, T., Nakase, H., Sakaki, T. Secondary spinal cord hypoperfusion of circumscribed areas after injury in rats. Neurol Res. 27 (4), 403-408 (2005).
- Cohen, D. M., et al. Blood-spinal cord barrier permeability in experimental spinal cord injury: dynamic contrast-enhanced MRI. NMR Biomed. 22 (3), 332-341 (2009).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (20), 8473-8478 (2011).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biol. 4 (2), e22 (2006).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), e38590 (2012).
- Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Sci Rep. 5, 9691 (2015).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 84-94 (2002).
- Walker, M. J., et al. A novel vertebral stabilization method for producing contusive spinal cord injury. J Vis Exp. (95), e50149 (2015).
- Anderson, K. D., Sharp, K. G., Steward, O. Bilateral cervical contusion spinal cord injury in rats. Exp Neurol. 220 (1), 9-22 (2009).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Zhang, Y. P., et al. Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences. J Neurotrauma. 25 (10), 1227-1240 (2008).
- Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. J Vis Exp. (124), (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, 1932 (2013).
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury. J Vis Exp. (93), e52228 (2014).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760 (2012).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
