In Vivoデュオ カラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法

すべての手術と動物の取り扱い手順を行ったガイドの下世話と実験動物の使用 (国立研究評議会)、インディアナ大学学校の医学機関動物ケアと使用のガイドラインを承認しました。委員会。 1. 手術の準備 背骨の安定剤を含むすべての手術器具を滅菌します。手術台と 70% エタノールを持つすべての周辺をきれい。非生存の手術の準備、37 ° C の加熱パッドの上にきれいな手術パッドを配置します。 この研究のための 6 週齢の SD) ラットを使用します。重さし、ケタミン (87.7 mg/kg) とキシラジン (12.3 mg/kg) 混合物の腹腔内注入ラットを麻酔します。つま先ピンチ刺激に応答する動物を停止すると、麻酔の適切な段階を確認します。皮下注入 0.01 0.05 mg/kg ブプレノルフィンと手術前にカルプロフェンを 5 mg/kg。 2 つのエリアでネズミを剃る: 背中と胸側に頸部領域に頚椎領域。手術時手洗い法 betadine と 70% アルコール綿で皮膚を綿棒します。手術中にドライアイを防ぐために眼軟膏を適用します。きれいな手術台の上に仰臥位に動物を配置します。 2. 外頚静脈カテーテル検査 鎖骨近くのパルス ポイントを見つけることによって外頚静脈を見つけて、3 解剖学的ポイントのクロス ポイントであるスポットに縦切開をする小さな春はさみでカット: より大きい結節右側下顎部の尾側枝上腕骨と胸骨柄 (図 1 a)。春のはさみと微細鉗子を使用して船を分離します。1 生殖不能の外科縫合線 (図 1)20遠位端を結ぶ。 生理食塩水で満たされ、21 g 針 (図 1 b) から作られた特殊なカテーテルを接続して 1 つの 1 mL シリンジを準備します。マイクロはさみのペアを使用して容器の小切開を行い、血管にカテーテルをスライドします。 両方近位および遠位終わり (図 1) を結ぶことによって針を固定します。特殊なカテーテルは、21 g 針から作られます。フラットの先端を挽くし、別の 21 g 針から切り離されて先端の 2 mm の部分を溶接します。これは外滑りからカテーテルを防ぐことができます。 注:針に流入する血液の量が少ないでは、針が血管を正常に入力されていることを示します。 3. 脊椎の安定化と C5 ・ C7 椎弓切除術 腹臥位で動物を配置します。15 番のメス刃で目的の脊髄レベルで正中線に沿って皮膚を切った7番目の頚椎外側面 (図 2 a)21を公開する二国間 (C5 C7) に 5thからの筋層を解剖します。 注:肩甲骨の間スパイクを見つけることによって第 2 胸椎 (T2) を探します。T2 椎骨の C7 椎21,22,23,24を見つけるから、カウントします。 変更された安定化装置を用いてラットの脊椎を安定させます。横の椎体骨の両側に切り込みを入れます。露出の横断プロセスの面の下にステンレス製アームをスライドさせ、安定性 (図 2 b) に固定するネジを締めます。 C5 ・ C7 ラミナ (椎弓切除術、図 2) を慎重に取り外します。 保湿成分 (図 2 D) 露出された硬膜の上に食塩水に浸した歳男の小片を置きます。 4. 2 光子 (2 P) 画像ウィンドウのインストール 筋肉と脊椎骨の間のギャップに弁の原料小片も脊髄と脊椎骨の間の弁の細い線のものし、筋肉骨周辺を密封する組織接着剤を使用します。完全な乾燥 (図 2 e) のための 5 分を待ちます。 注:この手順は効果的にウィンドウと浸漬溶液の水漏れしたために将来の出血を防ぎます。 DdH2電子レンジ O 4% 寒天培地を準備します。寒天が完全に解散した後は、触れることができる温度に戻るまでを待ちます。寒天液を 1 mL 滅菌注射器を入力し、(図 2 e) 壁を構築するウィンドウの端にパイプします。ソリューションはすぐに凝固し、レンズまたは目的を自由に移動できるようにする柔軟なままになります。 画像の準備ができたら、2 P (図 2 f) をイメージングのウィンドウ内弁と場所の浸漬液を削除します。2 光子励起顕微鏡暗い室内安定した動物を転送し、レンズ直下 2 P 画像ウィンドウを配置します。画像ウィンドウに慎重にレンズを下げます。 5. 最初の蛍光染料とベースライン イメージングの注入 ローダミン B イソチオ シアン酸デキストランの 0.5 ml (4 mg/mL 平均分子量 〜 70 kda) 生理食塩水で。ソリューションを 1 mL 滅菌注射器を入力し、以前にインストールされたカテーテルに注射器を接続します。 注:使用をお勧めする前に、蛍光色素溶液を準備しています。 非常にゆっくりと注射器を押すことによって最初の染料を注入 (図 3 b)。まず、関心のある領域を識別するために接眼レンズを使用します。電荷結合素子 (CCD) カメラを使用してランドマークのイメージとして低倍率で表面の血管パターンの明視野画像を取得します。レーザー スキャン モードに切り替えると、イメージング ソフトウェア両方の画像を収集するための 2 P を開き、ライン スキャン データ。 イメージを作成して、組織で使用されている fluorophores が付いている一致するように適切な 2 P レーザー励起波長、パワー、および蛍光チャネル (最初の染料の赤チャネル) を選択し、(図 3E)生体内イメージングを行います。全体のプロセスの間に加熱パッドで動物を飼います。 6 リサ デバイスを用いた C7 霊長類損傷 以前に確立されたプロトコル25,26によるとルイビルの負傷システム装置 (リサ) デバイスを使用して C7 正中線挫傷の傷害を実行します。 簡単に言えば、キャリブレーション リサ段階に動物を配置します。ゼロ点設定を選択して、組織の調整後は、変位 (この場合 0.800 mm) は、インパクターのリリースをトリガーし、傷害を作成するソフトウェアの「実験の実行」ボタンをクリックしてします。 傷害の後に、それはしっとり保つために露出された硬膜の上に食塩水に浸した弁の別の小さい部分を配置します。 4.3 のステップを繰り返し、以前に挿入した赤い染料で表示される同じ領域の生体内イメージングを再実行 (図 3 & F)。 手術台に裏では動物を転送し、IACUC IUSM プロトコルに従う適切な麻酔と鎮静動物を飼います。 7. 第 2 蛍光色素と受傷後イメージングの注入 フルオレセイン イソチオ シアン酸デキストラン (4 mg/mL、平均分子量 〜 70 kDa) の 0.5 mL を生理食塩水の準備 5.1 と同じ。1 mL 滅菌注射器でソリューションを入力し、以前にインストールされたカテーテルに接続します。 2 P 顕微鏡暗い室内安定化の動物の背部を転送し、同じ地域で最初の染料の赤のチャンネルや 2 番目の染料のための緑のチャネルを再イメージ (図 3 D & G)。 画像の最後に、脊柱安定化デバイスからラットを解放し、寒天の壁をきれい。 8. 動物の犠牲 イメージング後、次の transcardial 潅流プロトコル27ラットを犠牲に。脊髄のサンプルを収集し、4% でそれらを修正 PFA。 9. オフライン データ解析: 血管の定量化 オフライン解析用ワークステーションに画像ファイルを転送します。 ImageJ を開くと「ファイル」を選択、以前 raw データの保存選択し、関連付けられている単一のイメージ ファイル (図 4 b) を開きます。 「スケールを設定」(図 4) に続いて「分析」を選択して、画像を調整します。ピクセル単位での「距離」に指定された値は、図 4 aに表示されている数式を使用して計算されます。2 光子光レンズのキャリブレーションでは、式の既定値を決定します。”OpticalZoom”の値が Excel 拡張可能マークアップ Languagefile (XML ファイル) を単一のイメージ ファイル (図 4 b) に関連付けられているであります。 容器の長軸に垂直な線を引く (図 41 & E1)「測定」に続いて「分析」を選択。血管径の計測は、結果ウィンドウに表示されます (図 42 & E2)。平均値を取得する容器の間で 3 回を繰り返します。 10. オフライン データ解析: 赤い血の定量化細胞 (赤血球) 速度 ライン スキャン ファイルを分析のためワークステーションに転送します。 ImageJ ソフトウェアを起動「ファイル」を選択、以前 raw データの保存選択し、拡張子名”.ome”のすべての関連付けられた行スキャン ファイルを開きます。 「イメージ」を開き、「スタック画像」に続いて「スタック」を選択します。すべての青梅ファイルを 1 つの画像のスタックの TIFF ファイルに変換します。 Matlab ソフトウェアを起動して「開く」をクリックして、”LSPIV_parallel.m”コード ファイルを選択します。注意: LS PIV の Matlab コードは https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18でダウンロードできます。 次の注文を選択:「実行」>「フォルダーの変更」>「動脈」。10.3で生成された画像スタック TIFF ファイルを選択します。 “Y”を入力し、Enter キーを押します。 それぞれ、イメージの左右にカーソルを置き、プログラムがデータの処理を開始します。 プログラムの終わりには、最後の読み取りを計算する 2 つの値を入力してください:「pixel_meter 変換値」と「スキャン時の変換値」。両方は、ライン スキャン データに関連付けられている XML ファイルで見つけることができます。最終的な値は、平均とミリ (mm/秒) 単位での速度の標準偏差で表されます。