Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.
The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.
Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant’s own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.
ampirik tespit edilmiştir protokolü içinde kritik adımlar ele alınmıştır. Şırınga infiltrasyonu ile, peptit bazlı formülasyonlar stoma yoluyla bitki yaprak içinde hava boşluklarına yerleştirilir. Bitkiler yeterli su ve hafif süre boyunca ortam stomatal deliğin yani. Elverişli olan koşullar altında zaman çözeltinin maksimum alımını sağlamak için, süzme işleminin yapılması gerekir. (Mitokondrial hedefli DNA nakli için) iki peptitten oluşan bir kombinasyon içeren formülasyonlar için transfeksiyon komplekslerinin hazırlanması açısından, ile, her bir bileşenin ilavesi için dizi önemli ve ters olmamalıdır.
prosedüre birçok makul değişiklikler vardır. Bitki hücrelerinin infiltrasyonu için başka bir seçenek de dahil olmak üzere bütün bitkileri ve / veya kısmi dokulara karmaşık solüsyonun verilmesini mümkün vakum infiltrasyonu kullanımı,apikal meristemler. Bu alternatif prosedür için, fidan transfeksiyon çözeltisine batırılmış ve vakum tarafından oluşturulan basınca göre, peptid-kargo kompleksleri stoma yoluyla ve bitki hücrelerinde (Yoshizumi, T., yayınlanmamış veri) içine zorlanır.
Hayvan hücreleri üzerinde yapılan çalışmalara göre geçici gen ekspresyonu, yüksek DNA konsantrasyonları 29-31 arttığı gösterilmiştir. DNA peptid oranı komplekslerinin biyofiziksel özellikleri (boyut, yüzey yükü) etki not transfeksiyon verimini etkilemektedir (Şekil 4), önemlidir; Bu nedenle, en iyi oranı da artan bir DNA konsantrasyonu muhafaza edilmesi gerekmektedir.
Bir gen / protein teslim maddesi olarak peptidler kullanılarak ana avantajlarından biri olan sekansı, istenen işlevi yerine getirmek için ayarlanması için uygun olmasıdır. Örneğin, bir taşıyıcı peptidin mitokondriyal hedefleme alanı Bu damızlık tarifY, bu organellere lokalizasyonu için kloroplast ya peroksisomal-hedefleme sekansları ile ikame edilmiş olabilir. Kloroplast transformasyonu biyolistik 32-34 kullanarak çeşitli bitkilerde mümkün olsa da, Agrobacterium veya biyolistik yöntemi de çekirdeğin (Tablo 2) yanı sıra, mitokondri ya da diğer organellere genleri getirebilir.
Agrobacterium merkezli yöntem (Tablo 2) farklı olarak peptit bazlı transfeksiyon için bir bükülmez konakçı aralığına sınırlamaları vardır. Şu ana kadar, A. thaliana, N. benthamiana, kavak transfeksiyonu için formülasyonlar (Tablo 1) optimize edilmiştir, ancak yöntem, aynı zamanda, Nicotiana tabacum için de uygulanabilir, Domates çeşit mikro-Tom, pirinç (Hazırlık deneylerinde göre), ve diğer mono-ve çift filizli bitkiler.
peptidler kullanıldığında Şimdiye kadar, transgen büyüklüğü bilinen herhangi bir sınırlama yokturS transfeksiyonu vektörler. Bunun aksine, büyük DNA moleküllerinin Agrobakterium aracılı yöntemler 35,36 dönüşüm verimliliği ve 37-39 bildirilmiştir yaklaşık 200 kb'lik transgenler için üst bir sınır azaltmak için tespit edilmiştir. Biyolistik kullanımı ile, diğer taraftan, büyük DNA fragmanları bitki 38 içine hazırlama veya doğum sırasında kesilmiş olabilir. Bir üst sınırı kadar biyolistik transformasyonu için tespit edilmiştir, ancak, vücut kısıtlar daha az 150 kb 40 transfer edilebilir DNA boyutunu sınırlamak için tespit edilmiştir. Yukarıda ele alındığı Agrobacterium ya mikroprojektil bombardımanı, ya kullanılarak mevcut yaklaşımların karşılaştırıldığında gen transferi için peptit bazlı sistem kullanılarak büyük yararları, Tablo 2'de özetlenmiştir.
bu haliyle birkaç sınırlamalar bu yöntem için var. Birincisi, böyle bir mit olarak belirli organellere, için PDNA teslim hedefolmasına rağmen bu ochondria, DNA bağlama, hücreye nüfuz eden ve organel-geçiş dizilerinin basit bir kombinasyonu ile mümkün olduğu kanıtlanmıştır. Transgen ekspresyonu, sadece hücre içinde mitokondri küçük bir popülasyonda, konfokal mikroskobu ile tespit edilebilir. Hücre / organel zar boyunca daha komplekslerin translokasyon arttırmak ve (ii) söz hedef organel ayrışmasını ve taşıyıcı peptidden pDNA transferini geliştirmek: (i) Bu nedenle, başka modifikasyonlar için gereklidir. İkinci olarak, bu DNA verme sistemi ile, ekzojen raportör genlerin geçici ifade başarıyla hücrelerin sitosolik ve mitokondriyal bölmesinde elde edilmiştir. bitki nükleer / organel genomunda katılan genlerin istikrarlı birleşme ve ifade nedeniyle uygun seçim stratejilerinin olmaması, ancak, henüz kurulmuş değil.
kabul etmekle birlikte iyileştirme ya da daha fazla d alanlar olduğunuevelopment, burada açıklanan peptit türevi strateji çeşitli bitki türleri içine çeşitli yüklerin teslimatı için yolunu açmıştır basit ve çok yönlü bir tekniktir kalır.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı Keşif Araştırma İleri Teknoloji (JST-ERATO), Yeni Enerji ve Endüstriyel Teknoloji Geliştirme Örgütü (Nedo) ve Çapraz bakanlık Stratejik İnovasyon Tanıtım Programı (SIP), Japonya'dan fon kabul etmek istiyorum .
(KH)9-BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL |
(BP100)2-K8 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK |
BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYL |
Cytcox-(KH)9 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH |
P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10) |
pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751) |
dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS) | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39) |
GFP5 siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
CHS siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
1 mL and 10 mL Plastic Syringes | TERUMO Corporation | SS-01T, SS-10ESZ | |
1.5 mL Microcentrifuge Tube | AS ONE Corporation | 151212 | |
96-Well Flat-Bottom Plate | Asahi Glass Co., Ltd. | 3860-096 | |
Adhesive Tape | Sekisui Chemical Co., Ltd. | No. 835 | |
Alcohol Dehydrogenase | Sigma-Aldrich Co., LLC. | A-7011 | |
Atomic Force Microscope | Seiko Instruments Inc. | SPI3800, SPA 300HV | |
Atomic Force Microscope | Hitachi High-Tech Science Corporation | AFM5300E | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | 23227 | |
Cantilever | Hitachi High-Tech Science Corporation | K-A102001593 | |
Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
Cork Borer | Sigma-Aldrich Co., LLC. | Z165220 | For excision of leaves into 1-cm diameter disks |
Coverslip | Matsunami Glass Ind., Ltd. | C02261 | |
Cuvette | Sarstedt | 759116 | |
Folded Capillary Cell | Malvern Instruments, Ltd. | DTS1070 | |
Forceps | Shimizu Akira Inc. | Stainless pincet 150 | |
Homogenization Pestle | Ieda Trading Corp. | 9993 | |
Mica | Nisshin EM Co., Ltd. | LC23Z | |
Microcentrifuge | Beckman Coulter | BKA46472 | |
Microplate Reader | Molecular Devices Corporation | Spectra MAX M3 | |
Microscope Slide | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S011120 | |
Pipette | Eppendorf Research® plus | 3120000909 | |
Pipette Tips | AS ONE Corporation | 2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03 | |
Plastic Petri Dish | AS ONE Corporation | 1-7484-01 | |
Renilla Luciferase Assay Kit | Promega corporation | E2810 | |
Rhodamine B Isothiocyanate | Sigma-Aldrich Co., LLC. | 283924 | |
RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
Sodium Carbonate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-01585 | |
Surgical Blade and Handle | FEATHER Safety Razor Co., Ltd. | Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle) | |
Syringe Tip Cap | Musashi Engineering Inc. | NC-3E | |
Weighing Balance | Sartorius | CPA225D | |
Zeta Potentiometer | Malvern Instruments, Ltd. | Zetasizer Nano-ZS |