Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Jo-Ann Chuah; Yoko Horii; Keiji Numata

doi:10.3791/54972

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Genetik

펩타이드 유래의 방법은 식물의 유전자와 단백질 세포 간 및 Organellar 장벽을 수송하는

Published: December 16, 2016

doi:

10.3791/54972

Jo-Ann Chuah¹, Yoko Horii¹, Keiji Numata¹

¹Enzyme Research Team,RIKEN Center for Sustainable Resource Science

Özet

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Abstract

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Introduction

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems¹. By the introduction of new genes, the plant’s own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine².

Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery³, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)⁴, and electroporation⁵ or polyethylene glycol⁶ treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results⁷. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates⁸. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.

Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer⁹. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.

Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy^10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes^15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic^18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria²¹ or plastids (chloroplasts)²² for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins²³ and either express (plasmid^21,24 or double-stranded DNA²⁵) or down-regulate (double-stranded RNA²⁶) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space^24-26 or within a specific organellar compartment²¹. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K₈) or polylysine-co-histidine (KH)₉ for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

Protocol

펩타이드 기반 정립 1. 준비 다음 각 펩티드 원액을 준비한다 (KH) 9 -BP100 (1 ㎎ / ㎖ 또는 800 ㎚), Cytcox- (KH) (9) (1 ㎎ / ㎖), BP100 (1 ㎎ / ㎖) 및 (BP100) 2 K 8 (70 μM). 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 각각 펩티드의 요구량을 달아 펩티드를 용해 멸균 된 초순수를 추가한다. 맑은 용액이 얻어 질 때까지 반복 피펫 팅하여 잘 혼합한다. 증폭 플라스미드 DNA (pDNA에), 이중 가닥 DNA (dsDNA) 및 표준 분자 방법에 따라 이중 가닥 RNA (dsRNA를)를 정화. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에서, 1 ㎎ / ㎖ (의 pDNA 및 dsDNA) 또는 400 nm의 (dsRNA를)의 농도 재고 솔루션을합니다. 탄산나트륨 용액 (0.1 M, pH가 9) 1 ml의 단백질 (예., 알코올 탈수소 효소, ADH) 분말 1 mg을 용해시켜 7 μM의 농도로 단백질 원액을 준비한다. F와 단백질 라벨표준 프로토콜에 따라 같은 로다 민 B (RHB)와 같은 luorescent 프로브는 세포로 전달되는 단백질의 미세한 시각화를 가능하게합니다. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 각각의 성분을 결합한다. 펩티드 제제의 pDNA가 세포질 타겟팅, pDNA를 (1 ㎎ / ㎖) 20 μL를 6.4 μL (KH) 9 -BP100 (1 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 피펫 팅하여 잘 혼합한다. 혼합물을 25 ℃에서 15 분 동안 안정 할 수있다. 800 μL의 최종 부피로 용액을 희석하여 멸균 초순수 773.6 μL를 추가한다. 핵 식 (P35S-RLuc-TNOS, 표 1)에 대한 설계의 pDNA 구문을 사용합니다. 펩티드의 pDNA 제형은 미토콘드리아 타겟팅, pDNA를 (1 ㎎ / ㎖) 20 μL에 Cytcox- 6.6 μL (KH) (9) (1 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 피펫 팅하여 잘 혼합한다. 혼합물을 25 ℃에서 15 분 동안 안정하고 BP100 2.4 μL (1 ㎎ / ㎖)을 추가 할 수있다. 혼합물을 25 ℃에서 15 분 동안 안정화되도록6 또 다른 15 분 동안 C. 800 μL의 최종 부피로 용액을 희석하여 멸균 초순수 771 μL를 추가한다. 미토콘드리아 식 (: rluc, 표 1 pDONR-COX2)에 대한 설계의 pDNA 구문을 사용합니다. 펩티드 dsDNA 제형, dsDNA (1 ㎎ / ㎖) 8 μL를 5.1 μL (KH) 9 -BP100 (1 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 피펫 팅하여 잘 혼합한다. 혼합물을 25 ℃에서 15 분 동안 안정 할 수있다. 800 μL의 최종 부피로 용액을 희석하여 멸균 초순수 786.9 μL를 추가한다. 펩타이드 dsRNA를 제제를 들어, dsRNA를 (400 ㎚)의 50 μL에 50 μL (KH) 9 -BP100 (800 nm의)를 추가하고 피펫으로 잘 섞는다. 혼합물을 25 ℃에서 15 분 동안 안정 할 수있다. 800 μL의 최종 부피로 희석 용액의 RNA 분해 효소가없는 물을 700 μL를 추가한다. 펩티드 단백질 제제를 들어, ADH의 16 μL (7 μM)에 (BP100)이 K 8 (70 μM)의 16 μl를 추가하고 혼합잘 피펫으로. 혼합물을 25 ℃에서 15 분 동안 안정 할 수있다. 800 μL의 최종 부피로 용액을 희석하여 멸균 초순수 768 μL를 추가한다. 제형은 25 ° C에서 15 분 동안 안정화 할 수 있습니다. 펩타이드 기반 정립 2. 특성 동적 광산란 (DLS) 분석을위한 큐벳에 각 용액 (800 μL)를 옮긴다. 173 °의 산란 검출 각도 25 ° C에서 633 nm의 He-Ne 레이저를 사용하는 제타 nanosizer 형성된 복합체의 수력 학적 지름 및 다 분산도 지수를 결정한다. 다음 크기 측정은 25 ° C에서 유전 상수, 굴절률과 물의 점도 디폴트 파라미터에서 제타 전위 측정 접힌 모세관 셀에 각각의 용액 (800 μL)를 옮긴다. (AFM을 원자 힘 현미경으로 DLS 분석에 사용 착체 용액의 소량을 관찰). 운모 시트의 갓 노출 절단 표면에 예금 복잡한 용액 10 μl를하고 덮여 플라스틱 페트리 접시에 건조 하룻밤을 방송하기 위해 운모를 둡니다. 모드 27,28 태핑에 1.3 N / m의 스프링 상수 실리콘 캔틸레버를 사용하여 25 ℃에서 공기 중에서 복합체의 화상을 취득. 식물 잎의 3. 침투 삼주 된 토양에서 재배 한 식물 (애기 장대 (24), 담배 속의 benthamiana 24 포플러 26)를 사용합니다. 유전자 발현 또는 단백질 전달의 정량 세중의 역할을 최소한 3 잎을 형질. 한 잎의 형질 복잡한 용액 100 μL와 함께 1 ml의 바늘 플라스틱 주사기를로드합니다. 잎의 배축 표면에 주사기의 끝을 놓습니다. 약간 잎에 대한 주사기 팁을 누르고 난과 반대 압력을 행사하면서 천천히 주사기의 플런저를 우울반대편에서 라텍스 장갑을 낀 손의 ndex 손가락. 성공적인 침투는 잎에서 물에 젖은 영역의 확산을 관찰 할 수있다. 식별의 용이성에 대한 침투 잎 레이블. 펩티드의 pDNA (12 시간), 펩티드 dsDNA (12 시간), 펩타이드 dsRNA를 가진 침투 다음과 같은 최적화 된 기간에 대한 형질 전환 잎을 품어 – 다음과 같은 조건에서 (구 48 시간)과 펩티드 단백질 (6 시간) 공식 : 16 시간 빛 / N.의 benthamiana 29 ° C에서 A. 장대와 포플러, 또는 24 시간 일정한 빛에 대한 22 ° C에서 8 시간의 어둠. 형질 전환 효율 4. 평가 작은 식물의 전체 형질 전환 된 잎 (예., A. 장대) 또는 더 큰 식물에 대한 침투 영역의 1cm 2 절을 절제 (예., N. benthamiana). 레 닐라 루시퍼 라제 (Rluc) 리포터 벡터를 이용하여 형질 전환 실험의 경우, transfectio를 결정N 효율 Rluc 정량적 분석 키트를 사용. 1.5 ML의 microcentrifuge 관의 각을 절제 잎 또는 잎 부분을 놓습니다. 튜브 당 1 × Rluc 분석 용해 버퍼 100 μl를 추가합니다. 동일한 방식으로, 비 – 형질 제어 잎 (삼중)의 용 해물을 준비한다. 호모 유봉을 사용하여 리프 갈기 6, 25 ° C에서 얻어진 용 해물을 부화 – 10 시간. 1 분에 대한의 microcentrifuge에서 12,470 × g에서 해물을 원심 분리기. 전송 (20)를 96 웰 마이크로 플레이트의 웰의 분해물의 μL 및 제조자의 프로토콜에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 농도의 정량 남아있는 볼륨을 사용한다. 우물에 1 × Rluc 분석 기판합니다 (Rluc 분석 버퍼를 사용하여 희석)의 100 μl를 추가하고 천천히 피펫으로 혼합한다. 멀티 모드 마이크로 플레이트 리더의 마이크로 플레이트를 놓고 측정을 시작합니다. 배경 발광을 빼기 (무의 의미N-형질 각 실험 시료의 발광에서) 세중. 단백질의 양 (mg)을 포토 루미 네 선스의 비율 (상대 광 단위, RLU)을 계산한다. 녹색 형광 단백질 (GFP) 리포터 벡터 또는 형광 표지 된 단백질을 이용하여 형질 전환 실험 (예., ADH-RHB)는 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 형광을 관찰한다. 인 등의 단면 한 잎을 사용할 수 있지만, 전체 잎 (공기층의 제거를 돕기 위해)의 모서리를 잘라. 10 ML의 주사기에서 플런저를 제거하고 주사기의 각을 절제 잎 또는 잎 섹션을 배치합니다. 플런저를 교체하고 잎을 분쇄하지 않고 주사기의 바닥에 부드럽게 밀어 넣습니다. 이 반 정도 채워질 때까지 주사기에 물을 그립니다. 위쪽으로 주사기를 지정하고 팁을 통해 주사기에서 공기를 제거하기 위해 플런저에 밀어 넣습니다. 레아에서 공기를 추방 아래로 천천히 플런저를 주사기의 끝을 덮고 당겨에프. 잎이 반투명 나타날 때까지이 과정을 여러 번 반복합니다. 접착 테이프 현미경 슬라이드의 표면을 커버한다. 블레이드를 사용하여 잎 샘플을 수용 할 수있을만큼 큰 테이프에 사각형 영역을 잘라하고, 시료 챔버를 만들 집게와 테이프의 사각형 조각을 벗겨. 테이프 슬라이드와 커버 슬립 사이에 스페이서 역할을합니다. 위쪽으로 향하게 배축 표면과 챔버에 잎을 넣고 물을 나머지 챔버 영역을 채 웁니다. 유리 커버 슬립으로 챔버 내의 리프 밀봉 접착 테이프로 커버 슬립의 가장자리를 고정. 40 배 목표에서 공 초점 레이저 주사 현미경 또는 63X 물 침지 목표를 사용하여 잎 샘플을 검사합니다. GFP 또는 RHB 형광이 각각 488 내지 555 나노 미터의 여기 파장에서 가시화 될 수있다.

Representative Results

핵산과 단백질화물의 배열이 성공적으로 전달 벡터로 디자인 된 펩티드를 사용하여 다양한 식물에 도입되었다. 양이온 성 펩티드 및 음전하화물 사이의 정전 기적 상호 작용을 직접 무 바늘 주사기 (도 1)를 사용하여 잎 식물에 침투 할 수 형질 복합체의 형성의 결과. 식물 세포의 형질 전환을위한 (경험적으로 이러한 연구 21,23-26 결정)에 최적화 된 제형은 배달화물 (의 pDNA, dsDNA, dsRNA를 단백질)의 넓은 범위에있는 각 유형이 표시됩니다 표 1에 나열되어 있습니다. 300 나노 미터 – 모든 펩티드 제제의 평균 직경 (150)의 대략적인 범위에 있었다. DLS 분석에 기초하여, 모든 제제는 형성된 펩티드화물 골재가 균일 한 크기 분포를 가지고 있음을 나타내는, 상대적으로 낮은 크기의 분산도를 표시. 의 형태학펩타이드와의 pDNA (그림 2A) 또는 단백질 (그림 2B) 사이의 복합체는, 운모에, AFM에 의해 촬영되었다. 균일 한 구형 복합체 DLS 측정의 데이터와 일치, 두 펩타이드의 pDNA 및 펩티드 단백질 조합 관찰되었다. dsRNA를 계 복합체가 거의 중성 표면 전하를 가지는 동안 복합체 (표 1)의 제타 전위의 관점에서 pDNA- 및 dsDNA 유래 착물은 순 음극 표면 전하를 가지고 있었다. 펩티드 – 단백질 복합체는 반면에, 양으로 대전 하였다. 펩티드의 pDNA 모델 식물 시스템 등 A. 장대 또는 N.의 benthamiana의 형질을 매개 펩티드 dsDNA 제형의 효율이 질적으로뿐만 아니라 양적으로 평가 하였다. RLuc 유전자 발현 분석이 실험의 pDNA를 들어, 따라서, 유전자 발현 수준을 정량 (표 1)에 이용 된 또는RLuc 유전자를 코딩 dsDNA는 각각의 캐리어 펩타이드 복합체에 사용되어야한다. 약 1 × 105의 추정 RLU / mg의 값으로, 12 시간의 배양 기간에 이어 (KH) 9 -BP100 / pDNA를 배합 핵 타겟의 pDNA 전달 및 발현이 달성 될 수있는 사용. pDNA를 펩티드의 조합 미토콘드리아 타겟팅 전달 및 발현을 위해, Cytcox- (KH) 9 BP100은 복합체 형성이 필요. 12 시간의 최적화 동일한 잠복기로, 그러나, 형질 전환 (약 1 × 103 RLU / mg)의 더 낮은 수준을 달성 하였다. 한편, 유사한 잠복 기간 (12 시간) 유전자 발현 수준 (약 1 × 103 RLU / mg)를도 9 -BP100 펩티드를 (KH)를 사용하여 제제화 dsDNA 계 복합체에 대하여 / 요구되었다. 유전자 발현의 질적 평가는 단지를 위해 준비 할 처리 한 잎의 직접 현미경 관찰에 의해 수행되었다에드의 pDNA를 사용하거나 dsDNA는 GFP 리포터 유전자를 코딩. 비 표적 펩타이드의 pDNA 단지로 형질 세포에서 GFP 발현이 명확하게 관찰 세포질 (그림 3A)에서 지역화 발견에 대응하는 녹색 형광을 확산. GFP의 형광의 현지화 패턴에 뚜렷한 차이가 미토콘드리아 표적 펩타이드의 pDNA 단지와 침투 세포에서 분명했다. 여기서, 미토콘드리아 얼룩 colocalize 점상 녹색 형광 세포의 미토콘드리아 구획 (도 3b)에 독점적으로 유전자 발현의 특이성을 확인 가시적이었다. 펩티드 – 단백질 조성물의 경우, 형광 물질 (RHB)로 단백질화물 (ADH)의 접합은 세포 내 구획에서 전달 단백질의 시각화를 가능하게 할 것이다. 6 시간의 짧은 잠복기 내 ADH-RHB 단백질 (청색)에 걸쳐 분산되는 것으로 밝혀졌다세포질 및 침투 세포의 액포 (그림 3C). 한편, 유전자 발현의 신속하고 효율적인 하향 조절은 펩타이드의 dsRNA 제제를 사용하여 다양한 식물에서 달성 될 수있다. 첫 번째 실험에서는, A. 장대 잎이 펩티드 dsRNA를 침투시켰다 가뭄 조건 안토시아닌 (적색 안료) 생합성에 대한 책임이있는 칼콘 합성 효소 유전자 (CHS)를 침묵 복합체. A. 장대의 외관의 차이는 (b는 그림 3D) 최적화 된 펩타이드 dsRNA를 제제를 사용하여 침묵 CHS을 평가하는 쉬운 방법을 제공 가뭄 일반의 (a 그림 3D) (화살표 (1)가 침투 영역을 나타냄) 아래 나뭇잎. 두 번째 실험에서, 펩티드의 dsRNA 착물 옐로우 형광 단백질 (YFP)을 발현하는 트랜스 제닉 A. 장대의 잎에 침투 하였다. YFP 식 겉보기 감소 표피 세포 9 시간 p를 볼 수 있었다이스트 형질 (그림 3E, F). 다른 식물 시스템 (포플러, 12 시간 후 형질)의 하향 조절 유전자 발현의 제제의 효과는 (그림 3G, H) 확인되었다. 그림 1 : 살아있는 식물로 핵산과 단백질화물의 배달을위한 펩타이드 기반 제제. 설계된 캐리어 펩타이드는 세포 침투 또는 organellar 교통 서열에 결합 폴리 양이온으로 구성되어 있습니다. 폴리 양이온이 세포로 내재화 다음 엔도 좀 구획에서 및 / 또는 부정적으로 충전 된화물의 응축과 탈출을 결합 할 수 있습니다. 특정 소기관으로 세포로화물 배달, 이후 각각 세포 침투 시퀀스 및 organellar 교통 시퀀스에 의해 매개된다. successfu 될 수 있습니다 다양한화물에서야 플랜트 내로 전달은 혈청 알부민 (BSA), 알콜 탈수소 효소 (ADH)와 황 (황색 형광 단백질의 변형)과 같은 핵산 등의 pDNA, dsDNA 및 dsRNA를 같은 산뿐만 아니라 모델 단백질을 포함한다. 생체 활성 분자는 주사기 침윤 잎 식물에 도입 정전 기적 상호 작용을 통해 펩티드 접합체와 형질 복합체를 형성 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2 : 펩타이드 기반 제제의 형태학. (KH) N / P 0.5에서 9 -BP100 /의 pDNA 제형의 (A) AFM 진폭 이미지입니다. (B) (BP100) 몰 rati에서 2 K 8 / ADH 제형의 AFM 이미지 높이오 10. 게시 된 소스 (23, 24)에서 허가를 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3 : 최적화 된 펩타이드 기반 제제를 사용하여 형질 효율성의 현미경 평가. , A. 장대 스폰지 엽육 세포에서 관찰되었다 (A) 엽록소 형광도 (레드)에서 명확하게 구별 세포질 GFP 발현 (녹색)는 (KH) 9 -BP100 / pDNA를 제제 (N 침투 나뭇잎 / P 0.5 ~ 12 시간 ). (B) GFP 발현 (녹색)의 각 peptid 대한 Cytcox- (KH)로 침투 A. 장대 잎 9 / BP100 / pDNA를 제제 (N / P 0.5의 표피 세포의 미토콘드리아 (레드)에서 검출 된이자형; 12 시간). GFP 식 미토콘드리아의 확대 이미지는 맨 오른쪽 패널에 표시됩니다. A. 장대의 스폰지 엽육 세포로 ADH-RHB (파란색)의 (C) 배송은 10의 펩타이드 / 단백질의 몰 비율 (BP100) 2 K (8)에 의해 매개 6 시간 포스트 침투를 시각화 나뭇잎. 전 (D) A. 장대 잎 (a) 및 (KH) 9 -BP100 / dsRNA를 제제 (몰비 2; 48 시간)와 (b) 치료 후, 안토시아닌 생합성 경로의 억제 결과. GFP5 된 dsRNA를 함유하는 유사 제제는 대조군 (C)과 같은 판에 함침시켰다. 화살표 (2) 및 (4)는 판 내의 비 침투 영역을 표시하는 동안 화살표 (1)과 (3)는 침투 영역을 나타낸다. (E) A. thaliana의 황색 형광 단백질 (YFP) 및 (F)로 침윤 다음 감소 YFP 형광을 발현 잎 (KH) 9 -BP100 / dsRNA를 제제 (몰비이 9 시간). (G) 노란색 형광 단백질 (YFP) 및 (H) (KH) 9 -BP100 / dsRNA를 제형으로 감소 YFP 형광 다음 침투 발현하는 형질 전환 포플러 잎 (몰비이 12 시간을). 공개 소스 21,23,24,26에서 허가를 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4 :에-DNA 펩타이드 (N / P) 비율과 단지의 생물 물리학 특성에 미치는 영향에 변화. DNA 비율 펩티드가 증가함에 따라, 펩티드 제제는 제타 전위의 값으로 천이하는 동안 음극에서 양극으로 크기가 감소한다./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 표 1 특성화 및 다양한 펩티드 제제의 평가. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 표 2 : 본래 식물에 대한 펩타이드 기반 및 다른 기존의 DNA 전달 기술의 비교. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

경험적으로 확인 된 프로토콜 내에서 중요한 단계를 설명합니다. 주사기 침투함으로써 펩티드 제제가 기공을 통해 식물 잎 내부의 공극 내로 도입된다. 식물에 충분한 물과 점등 기간 동안 제공 기공 개구 예.에 이바지하는 조건 하에서 때 용액의 최대 흡수를 보장하기 위해, 함침 공정이 수행되어야한다. (미토콘드리아 타겟 DNA 전달을위한) 두 개의 펩티드의 조합을 포함하는 제제에 대한 형질 전환 복합체의 제조에 관해서는,로, 각 성분의 첨가 순서는 중요하고 반전 할 수 없습니다.

절차 많은 그럴듯한 수정이 있습니다. 식물 세포의 침윤을위한 또 다른 옵션을 포함한 전체 식물 및 / 또는 부분적인 조직으로 복잡한 솔루션을 도입 할 수있는 진공 함침의 사용이며혀끝의 분열 조직. 이러한 대안적인 절차는 모종 형질 감염 용액에 침지하고, 진공에 의해 생성 된 압력에 기초하여, 펩티드화물 착물은 기공을 통해 식물 세포 (Yoshizumi, T., 미발표 데이타)로 강제된다.

동물 세포를 이용한 연구 결과에 기초하여 일시적인 유전자 발현이 높은 DNA 농도 ^29-31에 따라 증가하는 것으로 나타났다. DNA에 펩티드의 비율이 단지의 생물 리 학적 특성 (크기, 표면 전하)에 영향을주의하는 형질 전환 효율에 영향을 미친다 (그림 4), 중요하다 따라서, 최적의 비율도 증가 DNA 농도가 유지되어야한다.

유전자 / 단백질 전달체로서 펩타이드를 사용의 주요 이점 중 하나는 시퀀스는 원하는 기능을 수행하기 위해 튜닝 의무가 있다는 것이다. 예를 들어, 담체 펩티드 미토콘드리아 타겟팅 도메인이 스터드에 기재된Y는 이들 소기관에 현지화 엽록체 또는 퍼 옥시 타겟팅 시퀀스로 대체 될 수있다. 엽록체 형질 전환은 바이오리 스틱스 (biolistics) ^{32 ~ 34를} 사용하여 여러 식물에서 가능하지만, 아그로 박테 리움이나 유전자 총 방법도는 핵 (표 2) 외에 미토콘드리아 등 세포 소기관으로 유전자를 도입 할 수있다.

아그로 박테 리움 기반 방법 (표 2)와 달리 펩타이드 기반 형질에 대한 엄격한 호스트 범위 제한은 없습니다. 지금까지, A. 장대, N. benthamiana의 포플러와의 형질 전환을위한 제형 (표 1)에 최적화되어 있지만, 상기 방법은 또한 된 담배에 적용 할 수있다 토마토 품종 마이크로 톰, 쌀 (예비 실험 기준) 및 기타 모노과 쌍떡잎 식물.

펩타이드가 사용되는 경우 아직 같이, 트랜스 규모 알려진 제한은 없다(S)의 형질 전환 벡터. 반대로, 대규모 DNA 분자는 아그로 박테 리움 – 매개 방법 ^{(35, 36)의} 변환 효율 및 ^{37-39를보고되었다} 약 200킬로바이트의 유전자에 대한 크기 상한을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 바이오리 스틱스 (biolistics)를 사용하여, 다른 한편으로는, 큰 DNA 단편은 식물 ⁽³⁸⁾ 제조시 전단 또는 전달 될 수있다. 상한은 원경과 유전자 형질 전환에 결정되어 있지 않지만, 물리적 제약이 훨씬 미만 150킬로바이트 ^(40)에 전송할 수있는 DNA의 크기를 제한하는 것으로 밝혀졌다. 상술 아그로 또는 충격 microprojectile를 이용하는 기존의 방법에 비해 유전자 전달 용 펩타이드 기반 시스템을 사용하는 주요 장점은 표 2에 요약되어있다.

그것은 약자로 몇 가지 제한 사항이 방법을 위해 존재한다. 우선, 예컨대 금속 절연체 전이 특정 소기관으로의 pDNA 전달 타겟팅효율이 낮은하지만 ochondria, DNA 결합, 세포 침투 및 세포 소기관 – 교통 시퀀스의 단순한 조합에 의해 가능 입증되었습니다. 유전자 발현은 단지 세포 내 미토콘드리아의 작은 집단에서, 공 초점 현미경에 의해 탐지 될 수있다. 셀 / organellar 막을 가로 질러 더 착체의 전위 향상, 및 (ii) 식의 대상 소기관으로 해리 캐리어 펩티드로부터의 pDNA의 전달을 개선한다 : (i) 따라서, 상기 변형에 필요하다. 둘째,이 DNA 전달 시스템을 사용하여, 외인성 리포터 유전자의 일시적 발현을 성공적 세포의 세포질과 미토콘드리아 구획에서 달성되었다. 식물 핵 / organellar 게놈에 도입 된 유전자의 안정된 통합 표현 인해 적합한 선택 전략의 부재로, 그러나 아직 확립되지 않았다.

인정하면서도 개선 또는 추가 개발을위한 영역이 있음evelopment는 여기에 설명 된 펩타이드 유래 전략은 다양한 식물 종류에 다양한화물의 배달을 위해 도로를 포장 한 간단하고 다양한 기술 남아있다.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 일본 과학 기술 청 탐색 적 연구 고급 기술에 대한 (JST-ERATO), 신 에너지 · 산업 기술 종합 개발기구 (NEDO) 및 크로스 장관급 전략 혁신 촉진 프로그램 (SIP), 일본에서 자금을 인정하고 싶습니다 .

Materials

(KH)₉-BP100 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL
(BP100)₂-K₈ peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK
BP100 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)₉ peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNA	N/A	N/A	For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNA	N/A	N/A	For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 mL and 10 mL Plastic Syringes	TERUMO Corporation	SS-01T, SS-10ESZ
1.5 mL Microcentrifuge Tube	AS ONE Corporation	151212
96-Well Flat-Bottom Plate	Asahi Glass Co., Ltd.	3860-096
Adhesive Tape	Sekisui Chemical Co., Ltd.	No. 835
Alcohol Dehydrogenase	Sigma-Aldrich Co., LLC.	A-7011
Atomic Force Microscope	Seiko Instruments Inc.	SPI3800, SPA 300HV
Atomic Force Microscope	Hitachi High-Tech Science Corporation	AFM5300E
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	23227
Cantilever	Hitachi High-Tech Science Corporation	K-A102001593
Confocal Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss	LSM700
Cork Borer	Sigma-Aldrich Co., LLC.	Z165220	For excision of leaves into 1-cm diameter disks
Coverslip	Matsunami Glass Ind., Ltd.	C02261
Cuvette	Sarstedt	759116
Folded Capillary Cell	Malvern Instruments, Ltd.	DTS1070
Forceps	Shimizu Akira Inc.	Stainless pincet 150
Homogenization Pestle	Ieda Trading Corp.	9993
Mica	Nisshin EM Co., Ltd.	LC23Z
Microcentrifuge	Beckman Coulter	BKA46472
Microplate Reader	Molecular Devices Corporation	Spectra MAX M3
Microscope Slide	Matsunami Glass Ind., Ltd.	S011120
Pipette	Eppendorf Research® plus	3120000909
Pipette Tips	AS ONE Corporation	2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Plastic Petri Dish	AS ONE Corporation	1-7484-01
Renilla Luciferase Assay Kit	Promega corporation	E2810
Rhodamine B Isothiocyanate	Sigma-Aldrich Co., LLC.	283924
RNase-Free Water	Qiagen	129112
Sodium Carbonate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	199-01585
Surgical Blade and Handle	FEATHER Safety Razor Co., Ltd.	Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)
Syringe Tip Cap	Musashi Engineering Inc.	NC-3E
Weighing Balance	Sartorius	CPA225D
Zeta Potentiometer	Malvern Instruments, Ltd.	Zetasizer Nano-ZS

Referanslar

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Peptide-derived Method Gene And Protein Transport Cellular And Organellar Barriers Plant Transformation Syringe-assisted Transfection Peptide-plasma DNA Formulation Dynamic Light Scattering Zeta Potential Atomic Force Microscopy Arabidopsis Thaliana

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Bu Makaleden Alıntı Yapın

Chuah, J., Horii, Y., Numata, K. Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants. J. Vis. Exp. (118), e54972, doi:10.3791/54972 (2016).