Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Jo-Ann Chuah; Yoko Horii; Keiji Numata

doi:10.3791/54972

JoVE Journal > Genetics

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Genetik

Peptid abgeleitete Methode zu schleusen Gene und Proteine über zelluläre und Organell-Barrieren in Pflanzen

Published: December 16, 2016

doi:

10.3791/54972

Jo-Ann Chuah¹, Yoko Horii¹, Keiji Numata¹

¹Enzyme Research Team,RIKEN Center for Sustainable Resource Science

Özet

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Abstract

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Introduction

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems¹. By the introduction of new genes, the plant’s own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine².

Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery³, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)⁴, and electroporation⁵ or polyethylene glycol⁶ treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results⁷. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates⁸. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.

Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer⁹. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.

Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy^10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes^15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic^18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria²¹ or plastids (chloroplasts)²² for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins²³ and either express (plasmid^21,24 or double-stranded DNA²⁵) or down-regulate (double-stranded RNA²⁶) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space^24-26 or within a specific organellar compartment²¹. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K₈) or polylysine-co-histidine (KH)₉ for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

Protocol

1. Herstellung von Peptidbasierte Formulierungen Vorbereitung Stammlösungen von jedem Peptid , wie folgt: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml oder 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) und (BP100) 2 K 8 (70 & mgr; M). Wiegen Sie die erforderliche Menge eines jeden Peptids in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen und autoklavierten Reinstwasser, um das Peptid aufzulösen. Gut mischen durch wiederholtes Pipettieren, bis eine klare Lösung erhalten wird. Amplifizieren, und die Plasmid-DNA (pDNA), doppelsträngige DNA (dsDNA) und doppelsträngige RNA (dsRNA) nach Standardmethoden Molekular reinigen. In 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Stammlösungen mit einer Konzentration von 1 mg / ml (pDNA und dsDNA) oder 400 nM (dsRNA) zu machen. Bereiten Sie die Protein – Stammlösung mit einer Konzentration von 7 uM, die durch Lösen von 1 mg des Proteins (z. B., Alkohol – Dehydrogenase, ADH) Pulver in 1 ml Natriumcarbonat – Lösung (0,1 M, pH 9). Beschriften Sie das Protein mit fluorescent Sonden wie Rhodamin B (RhB) Standardprotokollen nach mikroskopische Visualisierung der in die Zellen geliefert Protein zu ermöglichen. Kombinieren der jeweiligen Komponenten in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für Peptid-pDNA Formulierungen in das Zytoplasma Targeting, fügen 6,4 ul (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) zu 20 ul pDNA (1 mg / ml) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen 773,6 ul autoklaviert Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 & mgr; l zu verdünnen. Verwenden Sie das pDNA Konstrukt , das für Kernexpression (P35S-RLuc-tnos, Tabelle 1). Für Peptid-pDNA Formulierungen die Mitochondrien – Targeting, fügen 6,6 ul Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) zu 20 ul pDNA (1 mg / ml) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren und dann 2,4 ul BP100 (1 mg / ml) hinzufügen. Lassen Sie die Mischung für 15 min bei 25 zur Stabilisierung6; C für weitere 15 min. Hinzufügen 771 ul autoklaviertem Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 & mgr; l zu verdünnen. Verwenden Sie die pDNA – Konstrukt für mitochondriale Expression entworfen (pDONR-cox2: Rluc, Tabelle 1). Für Peptid-dsDNA Formulierungen, fügen 5,1 ul (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) auf 8 ul dsDNA (1 mg / ml) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen 786,9 ul autoklaviert Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 & mgr; l zu verdünnen. Für Peptid-dsRNA Formulierungen, fügen Sie 50 ul (KH) 9 -BP100 (800 nM) zu 50 ul dsRNA (400 nM) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen, 700 & mgr; l RNase-freiem Wasser, die Lösung auf ein Endvolumen von 800 & mgr; l zu verdünnen. Für Peptid-Protein – Formulierungen, fügen Sie 16 ul (BP100) 2 K 8 (70 & mgr; M) bis 16 & mgr; l von ADH (7 uM) und mischengut durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen 768 ul autoklaviertem Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 & mgr; l zu verdünnen. Erlauben die Formulierungen für 15 min bei 25 ° C zu stabilisieren. 2. Charakterisierung von Peptid-basierte Formulierungen Bringen Sie jede Lösung (800 ul) in eine Küvette für dynamische Lichtstreuung (DLS) Analyse. Bestimmen den hydrodynamischen Durchmesser und Polydispersitätsindex von gebildeten Komplexe mit einem zeta Nanosizer, mit einem 633 nm He-Ne-Laser bei 25 ° C mit einem Backscatter-Erfassungswinkel von 173 °. Folgende Größenmessungen, übertragen jede Lösung (800 ul) in eine gefaltete Kapillarzelle zum Zeta-Potential-Messungen an Standardparameter der Dielektrizitätskonstante, Brechungsindex und der Viskosität von Wasser bei 25 ° C. Beobachten eines kleinen Volumens von komplexen Lösung für DLS-Analyse verwendet, durch Rasterkraftmikroskopie (AFM). Kaution 10 ul-Komplex-Lösung auf die frisch freigelegten gespaltenen Oberfläche eines Glimmerplättchen und lassen Sie die Glimmer trocken über Nacht in einer bedeckten Petrischale aus Kunststoff an der Luft. Erwerben Sie ein Bild der Komplexe in Luft bei 25 ° C , um einen Silizium – Cantilever mit mit einer Federkonstante von 1,3 N / m in Tapping – Modus 27,28. 3. Einschleusung von Pflanzenblätter Verwenden Sie 3 Wochen alten Boden gewachsenen Pflanzen (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 oder Pappel 26). Transfizieren mindestens 3 Blätter als dreifacher Ausführung für die Quantifizierung von Genexpression oder Proteinabgabe zu dienen. Laden einer 1 ml Kunststoffspritze nadel mit 100 ul komplexe Lösung für die Transfektion eines Blattes. Positionieren Sie die Spitze der Spritze auf der abaxial Oberfläche des Blattes. Drücken Sie die Spritzenspitze gegen das Blatt leicht und drücken Sie den Spritzenkolben langsam, während ein Gegendruck mit dem i ausübtndex Finger eines Latex-Handschuh von der gegenüberliegenden Seite. Erfolgreiche Infiltration kann als die Ausbreitung eines mit Wasser getränkten Bereich in dem Blatt zu beobachten. Beschriften Sie die infiltrierten Blätter zur leichteren Identifizierung. Inkubieren der transfizierten Blatt für optimierte Dauern folgende Infiltration mit Peptid-pDNA (12 h), Peptid-dsDNA (12 h), Peptid-dsRNA (9-48 h) und Peptid-Protein (6 h) Formulierungen unter den folgenden Bedingungen: 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit bei 22 ° C für A. thaliana und Pappel oder 24 – Stunden – Dauerlicht bei 29 ° C für N. benthamiana. 4. Beurteilung der Transfektionseffizienz Excise die ganze transfizierten Blatt von kleineren Anlagen (z. B. A. thaliana) oder eine 1 cm 2 Abschnitt des infiltrierten Bereich für größere Anlagen (z. B. N. benthamiana). Für Experimente Transfektion Renilla – Luciferase (Rluc) Reportervektor verwendet, bestimmen die transfection Effizienz ein Rluc Assay Kit quantitativ verwenden. Legen Sie jedes Blatt herausgeschnitten oder Blattabschnitt in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 100 l 1 × Rluc Assay Lysepuffer pro Röhrchen. Auf die gleiche Weise, bereiten Lysaten von nicht transfizierten Kontrollblätter (dreifach). Grind das Blatt eine Homogenisierung zerstoßen und Inkubation des resultierenden Lysat bei 25 ° C für 6 bis 10 Stunden. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.470 × g in einer Mikro für 1 min. Transfer 20 & mgr; l des geklärten Lysat auf eine Vertiefung in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, und verwenden die verbleibende Volumen für die Quantifizierung der Gesamtproteinkonzentration eines BCA Protein Assay Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. 100 l 1 × Rluc Assay Substrat (verdünnt, um die Rluc Testpuffer verwendet wird) in den Brunnen und mischen durch langsame Pipettieren. Legen Sie die Mikrotiterplatte in einem Multimode-Mikroplatten-Reader und initiieren Messung. Ziehen Sie den Hintergrund Lumineszenz (Mittelwert der keinn-transfizierten dreifacher Ausfertigung) von jeder Lumineszenz der Versuchsprobe. Berechnen des Verhältnisses von Photolumineszenz (relative light units, RLU) zu der Menge an Protein (mg). Für Transfektionsexperimente grün fluoreszierende Protein (GFP) Reportervektor mit oder fluoreszenzmarkierten Protein (z. B. ADH-RhB), beobachten die Fluoreszenz eines konfokalen Laser – Scanning – Mikroskop. Schneiden Sie die Ränder eines ganzen Blattes (die Entfernung von Lufträumen zu unterstützen), während eine geschnittene Blatt kann verwendet werden, wie es ist. Entfernen Sie den Kolben aus einer 10-ml-Spritze und legen jeweils herausgeschnitten Blatt oder Blattabschnitt in der Spritze. Setzen Sie den Kolben und drücken Sie sie sanft auf den Boden der Spritze ohne das Blatt zerdrücken. Zeichnen Sie Wasser in die Spritze, bis es etwa die Hälfte gefüllt ist. Richten Sie die Spritze nach oben und drücken in der Kolben Luft aus der Spritze durch die Spitze zu entfernen. Decken Sie die Spitze der Spritze und ziehen Sie den Kolben langsam nach unten Luft aus dem lea zu vertreibenf. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, bis das Blatt durchscheinend erscheint. Bedecken die Oberfläche eines Objektträgers mit einem Klebeband. Schneiden Sie eine quadratische Fläche auf dem Band groß genug, um die Blattprobe unter Verwendung einer Klinge aufzunehmen, und ziehen Sie das Quadrat Stück Klebeband mit einer Pinzette aus einer Probenkammer zu schaffen. Das Band wird als Abstandshalter zwischen dem Schieber und Deckglas dienen. Legen Sie das Blatt in der Kammer mit dem abaxial Oberfläche nach oben zeigt und füllen die verbleibende Kammerbereich mit Wasser. Dichten Sie das Blatt in der Kammer mit einem Deckglas und sichern Sie die Kanten des Deckglases mit Klebeband. Überprüfen Sie die Blattprobe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop unter einem 40X-Objektiv oder ein 63X Wasserimmersionsobjektiv verwendet wird. GFP oder RhB Fluoreszenz kann bei Anregungswellenlängen von 488 nm bzw. 555 nm bzw. sichtbar gemacht werden.

Representative Results

Ein Array von Nukleinsäure und Protein Ladungen wurden erfolgreich in verschiedene Pflanzen eingebracht, die entworfen Peptide als Zuführungsvektoren verwendet wird. Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen kationischen Peptiden und negativ geladenen Ladungen führte zur Bildung von Transfektionskomplexen , die direkt in die Pflanzen infiltriert werden können Blätter eine nadellose Spritze (Abbildung 1). Optimierte Formulierungen (empirisch in diesen Studien bestimmt 21,23-26) für die Transfektion von Pflanzenzellen sind in Tabelle 1 aufgeführt, wobei jeder Typ der Vielzahl von gelieferten Ladungen (pDNA, dsDNA, dsRNA und Protein) dargestellt wird. Die mittleren Durchmesser aller peptidbasierten Formulierungen wurden in ungefähren Bereich von 150 bis 300 nm. Basierend auf DLS-Analyse zeigten alle Formulierungen relativ geringe Größe Polydispersitäten, was darauf hinweist, dass die gebildeten Peptid-Fracht-Aggregate eine einheitliche Größenverteilung aufweisen. Die MorphologienKomplexe zwischen Peptid und pDNA (2A) oder Protein (2B), auf Glimmer wurden durch AFM abgebildet. Homogene globuläre Komplexe wurden mit den Daten von DLS-Messungen für beide Peptid-pDNA und Peptid-Protein-Kombinationen in Übereinstimmung beobachtet. In Bezug auf das Zetapotential von Komplexen (Tabelle 1), pDNA- und dsDNA abgeleitete Komplexe hatten negative Nettooberflächenladungen während dsRNA-basierte Komplexe eine nahezu neutrale Oberflächenladung hatte. Peptid-Protein-Komplexe, auf der anderen Seite, wurden positiv geladen. Die Wirkungsgrade von Peptid-pDNA und Peptid-dsDNA Formulierungen in der Transfektion von A. thaliana oder N. benthamiana als Modellpflanze Systeme Vermittlung wurden als qualitativ quantitativ als auch bewertet. Rluc Genexpression Assay für die Quantifizierung von Genexpressionsniveaus (Tabelle 1), daher für dieses Experiment verwendet wurde , oder pDNAdsDNA Rluc-Gen kodiert, müssen zur Komplexierung mit den jeweiligen Träger Peptide verwendet werden. Mit dem (KH) 9 -BP100 / pDNA Formulierung kann nuklear gezielte Abgabe und Expression von pDNA erreicht werden, nach einer Inkubationszeit von 12 Stunden mit einem geschätzten RLU / mg – Wert von etwa 1 × 10 5. Für mitochondriale-zielgerichtete Abgabe und Expression von pDNA, eine Kombination von Peptiden, Cytcox- (KH) 9 und BP100, wird für die Komplexbildung erforderlich ist . Mit der gleichen optimierten Inkubationszeit von 12 Stunden jedoch eine viel niedrigere Niveau der Transfektion (etwa 1 × 10 3 RLU / mg) wurde erreicht. Inzwischen ähnliche Inkubationszeit (12 h) und Gen – Expressionsniveau (etwa 1 × 10 3 RLU / mg) wurde erforderlich / aufgezeichnet für dsDNA-Komplexen, auch die (KH) 9 -BP100 Peptid formuliert werden. Qualitative Bewertung der Genexpression wurden durch direkte mikroskopische Beobachtung der Blätter mit Komplexe prepar behandelt durchgeführted mit pDNA oder dsDNA kodiert, das GFP-Reporter-Gen. In Zellen , die mit Nicht-Zielpeptid-pDNA – Komplexen transfiziert, diffundieren grüne Fluoreszenz mit entsprechenden GFP – Expression deutlich beobachtet wurde und die in das Cytosol (3A) zu lokalisieren. Deutliche Unterschiede in der Lokalisation Muster der GFP-Fluoreszenz waren in Zellen offensichtlich mitochondrialen gezielte Peptid-pDNA Komplexe infiltriert mit. Hier punctate grüne Fluoreszenz , die mit der mitochondrialen stain colokalisieren sichtbar war, was die Spezifität der Genexpression ausschließlich in der mitochondrialen Kompartiment von Zellen (3B) bestätigt. Im Fall von Peptid-Protein-Formulierungen, Konjugation des Proteins Ladung (ADH) mit einem Fluorophor (RhB) wird die Visualisierung des gelieferten Protein im intrazellulären Kompartiment ermöglichen. Innerhalb einer kurzen Inkubationszeit von 6 Stunden, ADH-RhB Protein (blau) wurde festgestellt, überall verteilt werdendas Cytosol und Vakuole von infiltrierten Zellen (3C). unter Verwendung von Peptid-dsRNA Formulierungen Inzwischen konnte eine schnelle und effiziente Herunterregulation der Genexpression in verschiedenen Anlagen durchgeführt werden. Im ersten Experiment, A. thaliana Blatt wurde mit dem Peptid-dsRNA infiltriert Komplexe der Chalkon – Synthase – Gen (CHS) verantwortlich für Anthocyan (rotes Pigment) Biosynthese unter Dürrebedingungen zum Schweigen zu bringen. Der Unterschied im Auftreten von A. thaliana Blätter unter normalen (3D, a) und Trockenheit (3D, b) ein einfaches Mittel vorgesehen CHS zu bewerten Silencing die optimierte Peptid-dsRNA – Formulierung unter Verwendung von (Pfeil 1 zeigt die infiltriert region). In dem zweiten Experiment wurden Peptid-dsRNA – Komplexe wurden in den Blättern von transgenen A. thaliana infiltriert gelb fluoreszierendes Protein exprimieren (YFP). Eine scheinbare Reduktion der YFP-Expression konnte in den epidermalen Zellen 9 h p zu sehenOst-Transfektion (3E, F). Die Wirksamkeit der Formulierung in Herunterregulierung der Genexpression in einem anderen Anlagensystem (Pappel, 12 h nach der Transfektion) wurde ebenfalls nachgewiesen (Abbildung 3G, H). Abbildung 1: Peptid-basierte Formulierungen für die Lieferung von Nukleinsäure und Protein Cargoes in lebenden Pflanzen. Die entworfenen Träger Peptide bestehen aus Polykationen zu Zelle eindringende oder organellären Transitsequenzen konjugiert. Polykationen ermöglichen Bindung und / oder Kondensation von negativ geladenen Ladungen sowie Flucht aus dem endosomalen Kompartiment in Zellen nach Verinnerlichung. Lieferung von Ladungen in die Zellen und anschließend auf spezifische Organellen wird durch Zelle eindringende Sequenzen und Organell-Transitsequenzen vermittelt sind. Verschiedene Ladungen, die successfu sein könntelly in die Anlage geliefert umfassen Nukleinsäuren wie pDNA, dsDNA und dsRNA sowie Modellproteine wie Rinderserumalbumin (BSA), Alkoholdehydrogenase (ADH) und Citrin (eine Variante von gelb fluoreszierendes Protein). Bioaktive Moleküle können Transfektionskomplexe mit Peptidkonjugaten über elektrostatische Wechselwirkungen zu bilden, die in Pflanzen eingeführt werden Blätter mit einer Spritze Infiltration. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2: Morphologien der Peptid-basierte Formulierungen. (A) AFM Amplitudenbild von (KH) 9 -BP100 / pDNA Formulierung bei N / P 0,5. (B) AFM Höhenbild von (BP100) 2 K 8 / ADH Formulierung bei Molaren Ratio 10. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus veröffentlichten Quellen 23,24. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3: Die mikroskopische Beurteilung von Transfektionseffizienzen Peptid-basierte Formulierungen unter Verwendung optimiert. (A) Cytosolic GFP – Expression (grün), deutlich von Chloroplasten – Autofluoreszenz (rot), wurde in den Schwammparenchym Zellen von A. thaliana beobachtet Blätter infiltriert mit (KH) 9 -BP100 / pDNA Formulierung (N / P 0,5; 12 h ). (B) die GFP – Expression (grün) wurde in den Mitochondrien (rot) in den epidermalen Zellen von A. thaliana leaf infiltriert mit Cytcox- (KH) 9 / BP100 / pDNA Formulierung (N / P 0,5 für jede peptid detektierte; 12 h). Vergrößerte Bilder von Mitochondrien mit GFP-Expression sind im äußersten rechten Bereich angezeigt. (C) Lieferung von ADH-RhB (blau) in die Schwammparenchym Zellen von A. thaliana Blätter durch (BP100) 2 K 8 in einem Peptid / Protein – Molverhältnis von 10, visualisiert 6 Stunden nach der Infiltration vermittelt. (D) A. thaliana leaf vor (a) und nach (b) Behandlung mit (KH) 9 -BP100 / dsRNA – Formulierung (Molverhältnis 2; 48 h), die bei der Unterdrückung der Anthocyan – Biosynthesewegs geführt. Eine ähnliche Formulierung GFP5 dsRNA enthielt , wurde in das Blatt als negative Kontrolle (c) infiltriert. Pfeile 1 und 3 zeigen den infiltrierten Bereich, während Pfeile 2 und 4, um die nicht-infiltrierten Bereich innerhalb des Blattes an. (E) A. thaliana verlässt folgende Infiltration gelb fluoreszierendes Protein (YFP) und (F) , um die verminderte YFP – Fluoreszenz zum Ausdruck mit (KH) 9 -BP100 / dsRNA – Formulierung (Molverhältnis 2; 9 h). (G) Transgenic Pappel Blätter gelb fluoreszierendes Protein (YFP) und (H) die verminderte YFP – Fluoreszenz folgende Infiltration mit (KH) 9 -BP100 / dsRNA Formulierung exprimieren (Molverhältnis 2; 12 h). Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus veröffentlichten Quellen 21,23,24,26. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4: Variation in Peptid-zu-DNA (N / P) Verhältnis und die Auswirkung auf die biophysikalischen Eigenschaften von Komplexen. Mit zunehmender Peptid zu DNA-Verhältnis, Peptid-basierten Formulierungen Abnahme der Größe, während deren Zeta-Potentialwerte Übergang von negativ zu positiv./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Tabelle 1: Charakterisierung und Bewertung verschiedener Peptid-basierte Formulierungen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen. Tabelle 2: Ein Vergleich von Peptid-basierten und anderen vorhandenen DNA – Delivery – Technologien für Intact Pflanzen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

Discussion

Kritischen Schritte in dem Protokoll, die empirisch diskutiert wurden identifiziert. Durch die Spritze Infiltration, die Peptid-basierten Formulierungen werden in die Lufträume im Inneren der Pflanze Blatt durch die Spaltöffnungen eingeführt. Um eine maximale Aufnahme der Lösung zu gewährleisten, sollte der Infiltrationsverfahren durchgeführt werden , wenn die Pflanzen unter Bedingungen, die zur Öffnung der Stomata dh förderlich sind., Versehen mit ausreichend Wasser und während der Lichtperiode. Im Hinblick auf die Herstellung von Transfektionskomplexen für Formulierungen, die eine Kombination von zwei Peptiden (für mitochondrialen DNA-Zielliefer) umfassen, wobei die Reihenfolge für die Zugabe der einzelnen Komponenten ist entscheidend und nicht invertiert werden sollte.

Es gibt viele plausible Änderungen an dem Verfahren. Eine andere Möglichkeit für das Eindringen von Pflanzenzellen ist die Verwendung von Vakuuminfiltration, die die komplexe Lösung zu ganzen Pflanzen einzuführen ist in der Lage und / oder Teilgeweben, einschließlichApikalmeristemen. Für diese alternativen Verfahren werden Sämlinge in der Transfektionslösung eingetaucht, und basierend auf dem Druck, der durch das Vakuum erzeugt wird, die Peptid-Fracht Komplexe werden durch die Stomata und in die Pflanzenzellen (Yoshizumi, T., nicht veröffentlichte Daten) gezwungen.

Transient Genexpression, basierend auf Studien an tierischen Zellen wurde mit höheren DNA – Konzentrationen ^{von 29 bis 31} zu erhöhen gezeigt. Es ist wichtig zu beachten , dass das Verhältnis von Peptid zu DNA , die die biophysikalischen Eigenschaften beeinflusst (Größe, Oberflächenladung) von Komplexen (Abbildung 4), die Transfektionseffizienz beeinflusst; Daher muss das optimale Verhältnis auch bei erhöhter DNA-Konzentration gehalten werden.

Einer der Hauptvorteile in Peptide als ein Gen / Protein-Zusteller ist, dass seine Sequenz zum Einstellen zugänglich ist, eine gewünschte Funktion zu erfüllen. Zum Beispiel beschrieb der mitochondrialen-Targeting-Domäne des Trägerpeptid in diesem Gestüty kann mit Chloroplasten oder Peroxisomen-Targeting-Sequenzen für die Lokalisierung zu dieser Organellen ersetzt werden. Während Chloroplast – Transformation in mehrere Anlagen möglich ist , unter Verwendung Biolistik ^32-34 weder das Agrobacterium noch der biolistischen Methode könnte Gene in die Mitochondrien oder anderen Organellen neben dem Kern (Tabelle 2) einzuführen.

Es sind keine starren Wirtsbereich Einschränkungen für Peptid-basierende Transfektion, im Gegensatz zu dem Agrobacterium basierende Verfahren (Tabelle 2). Bisher Formulierungen für die Transfektion von A. thaliana, N. benthamiana und Pappel optimiert wurden (Tabelle 1), aber das Verfahren kann auch für Nicotiana tabacum verwendet werden, Tomatenzüchtung Micro-Tom, Reis (basierend auf Vorversuchen) und andere mono- und dikotyle Pflanzen.

Bisher gibt es keine bekannte Beschränkung in Transgen Größe, wenn Peptide ein verwendet werdens Transfektionsvektoren. Im Gegensatz dazu wurden große DNA – Moleküle wurden für die Transgene von etwa 200 kb wurde ^37-39 berichtet die Transformationseffizienz von Agrobacterium -vermittelte Methoden ^35,36 und eine obere Größenbegrenzung zu reduzieren gefunden. Verwendung von Biolistik, andererseits, große DNA – Fragmente können ³⁸ während der Herstellung oder Lieferung in Pflanzen geschert werden. Obwohl keine obere Grenze hat für biolistische Transformation bisher physikalische Zwänge wurden , um die Größe der DNA zu beschränken gefunden , die übertragen werden kann , um viel weniger als 150 kb ⁴⁰ bestimmt. Die Hauptvorteile der Verwendung des Peptid-basierten System für den Gentransfer im Vergleich zu bestehenden Ansätze entweder Agrobacterium oder Mikroprojektilbeschuss verwendet wird , oben erläutert, sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Einige Einschränkungen gibt es für dieses Verfahren, wie es steht. Erstens gezielte Abgabe von pDNA auf spezifische Organellen, wie dem mitochondria, wurde durch eine einfache Kombination von DNA-bindenden, zellpenetrierenden und Organell-Transitsequenzen möglich erwiesen, obwohl der Wirkungsgrad niedrig war. Transgen-Expression konnte festgestellt werden, durch konfokale Mikroskopie, nur in einer kleinen Population von Mitochondrien in den Zellen. Daher sind weitere Modifikationen notwendig: (i) Förderung der Translokation von mehr Komplexe durch die Zelle / Organell-Membran, und (ii) zur Expression der Dissoziation und die Übertragung von pDNA aus dem Trägerpeptid in das Ziel Organell verbessern. Zweitens wurde die transiente Expression von exogener Reportergene unter Verwendung dieses DNA-Abgabesystem, erfolgreich in den zytosolischen und mitochondrialen Kompartiment von Zellen erreicht. Stabile Inkorporation und die Expression der eingeführten Gene in der Pflanze Kern / Organell-Genoms noch nicht jedoch festgestellt worden ist, aufgrund des Fehlens von geeigneten Selektionsstrategien.

Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass es Bereiche für Verbesserungen oder weitere development, das Peptid abgeleitete Strategie beschrieben hier bleibt eine einfache und vielseitige Technik, die den Weg für die Lieferung verschiedener Ladungen in verschiedene Pflanzenarten geebnet hat.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten die Finanzierung anzuerkennen aus Japan Science and Technology Agency Exploratory Research für Advanced Technology (JST-ERATO), die Neue Energie und Industrial Technology Development Organization (NEDO) und Cross-Minister Strategic Innovation Promotion Program (SIP), Japan .

Materials

(KH)₉-BP100 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL
(BP100)₂-K₈ peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK
BP100 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)₉ peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNA	N/A	N/A	For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNA	N/A	N/A	For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 mL and 10 mL Plastic Syringes	TERUMO Corporation	SS-01T, SS-10ESZ
1.5 mL Microcentrifuge Tube	AS ONE Corporation	151212
96-Well Flat-Bottom Plate	Asahi Glass Co., Ltd.	3860-096
Adhesive Tape	Sekisui Chemical Co., Ltd.	No. 835
Alcohol Dehydrogenase	Sigma-Aldrich Co., LLC.	A-7011
Atomic Force Microscope	Seiko Instruments Inc.	SPI3800, SPA 300HV
Atomic Force Microscope	Hitachi High-Tech Science Corporation	AFM5300E
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	23227
Cantilever	Hitachi High-Tech Science Corporation	K-A102001593
Confocal Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss	LSM700
Cork Borer	Sigma-Aldrich Co., LLC.	Z165220	For excision of leaves into 1-cm diameter disks
Coverslip	Matsunami Glass Ind., Ltd.	C02261
Cuvette	Sarstedt	759116
Folded Capillary Cell	Malvern Instruments, Ltd.	DTS1070
Forceps	Shimizu Akira Inc.	Stainless pincet 150
Homogenization Pestle	Ieda Trading Corp.	9993
Mica	Nisshin EM Co., Ltd.	LC23Z
Microcentrifuge	Beckman Coulter	BKA46472
Microplate Reader	Molecular Devices Corporation	Spectra MAX M3
Microscope Slide	Matsunami Glass Ind., Ltd.	S011120
Pipette	Eppendorf Research® plus	3120000909
Pipette Tips	AS ONE Corporation	2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Plastic Petri Dish	AS ONE Corporation	1-7484-01
Renilla Luciferase Assay Kit	Promega corporation	E2810
Rhodamine B Isothiocyanate	Sigma-Aldrich Co., LLC.	283924
RNase-Free Water	Qiagen	129112
Sodium Carbonate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	199-01585
Surgical Blade and Handle	FEATHER Safety Razor Co., Ltd.	Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)
Syringe Tip Cap	Musashi Engineering Inc.	NC-3E
Weighing Balance	Sartorius	CPA225D
Zeta Potentiometer	Malvern Instruments, Ltd.	Zetasizer Nano-ZS

Referanslar

Altman, A., Hasegawa, P. M. . Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , (2011).
Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).
Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 327, 70-73 (1987).
Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).
Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature. 296, 72-74 (1982).
Birch, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).
Newell, C. A. Plant transformation technology. Developments and applications. Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).
Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria–a rare event?. FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).
Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K., Cai, W. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. Engineering in Translational Medicine. , 667-689 (2014).
Nitta, S., Numata, K. Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).
Numata, K. Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials. Polym. J. 47, 537-545 (2015).
Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based delivery systems of bioactive molecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).
Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).
Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).
Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells. ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).
Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).
Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).
Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery. Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).
Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery. Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).
Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers. Sci. Rep. 5, 7751 (2015).
Numata, K., Yoshizumi, T., Kodama, Y. Plant transformation method. Patent. , (2015).
Ng, K. K., et al. Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides. PLoS ONE. 11, e0154081 (2016).
Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers. Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).
Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes. Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).
Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).
Numata, K., et al. Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates. Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).
Numata, K., et al. Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM. Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).
Kawai, S., Nishizawa, M. New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide. Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).
Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
Luo, D., Saltzman, W. M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface. Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).
Boynton, J. E., et al. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science. 240, 1534-1538 (1988).
Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. Plastid transformation. Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).
Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).
Liu, Y. G., et al. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).
Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).
Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).
Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).
Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).
Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L., Bajaj, Y. P. S. Transgenic wheat (Triticum spp.). Transgenic Crops I. , 14-36 (2000).

Etiketler

Peptide-derived Method Gene And Protein Transport Cellular And Organellar Barriers Plant Transformation Syringe-assisted Transfection Peptide-plasma DNA Formulation Dynamic Light Scattering Zeta Potential Atomic Force Microscopy Arabidopsis Thaliana

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Chuah, J., Horii, Y., Numata, K. Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants. J. Vis. Exp. (118), e54972, doi:10.3791/54972 (2016).

Peptid abgeleitete Methode zu schleusen Gene und Proteine ​​über zelluläre und Organell-Barrieren in Pflanzen