This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.
Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.
Tipos I y III interferones (IFN) son críticos en la respuesta inmune a los virus y otros estímulos patógenos y presente en todos los vertebrados 1. Las células inmunes y no inmunes expresan y secretan, así como responder a, IFN 2. Sensores de inmunidad innata, como los receptores tipo Toll (TLR), picadura, y RIG-I, inducen tipo I y III IFN expresión ante la detección de patógenos patrones moleculares asociados (PAMP) 3,4. En los seres humanos, IFN de tipo I incluyen IFN-β, -ω, -κ, y 12 subtipos de IFN-α, y se unen al receptor IFNAR1 / IFNAR2 complejo de 2,5. Tipo III IFN incluyen IFN-λ1, -λ2, y -λ3 y se unen al complejo receptor IL10RB / IL28RA 2. Clásicamente, los tipos I y III IFN se unen a sus respectivos complejos de receptores que a su vez reclutan STAT1 / heterodímeros STAT2 e iniciar la transcripción de genes de interferón estimulado (ISG) 6. ISG están involucrados en una amplia gama de funciones, desde antiviral y antila actividad proliferativa a la activación de la respuesta inmune adaptativa 7.
Los numerosos mecanismos patógenos han evolucionado para evadir, subvertir, y secuestrar elementos de la vía de señalización de IFN demuestran la importancia de IFN en la respuesta inmune innata 8. Por ejemplo, el virus vaccinia expresa un receptor señuelo con homología IFNAR1 que secuestra IFN tipo I 9 mientras que un virus de la enfermedad Yaba-como segrega una glicoproteína que inhibe las proteínas de tipo I y III IFN 10. Además de su papel en la defensa del huésped, IFN también están implicadas en la vigilancia del cáncer y una serie de enfermedades auto-inflamatoria: silenciamiento de la expresión de IFN en células de cáncer de mama restringe inmunovigilancia 11, la sobreproducción de IFN-α es un mecanismo en el desarrollo de sistémico lupus eritematoso 12, y la activación errante de STING conduce a la inflamación sistémica causada por cantidades excesivas de IFN en la vasculopatía STING-asociado13. Terapéuticamente, IFN se utilizan para tratar la esclerosis múltiple 14, infecciones virales crónicas, tales como HBV y HCV 16,17 15, y los cánceres tales como la leucemia de células pilosas 18 y leucemia mielógena crónica 19. Preguntas sobre la relevancia de IFN en un proceso fisiológico particular, revelan continuamente la naturaleza ubicua de esta familia de citoquinas.
Tipo I IFN, especialmente los subtipos de IFN-α, a menudo considerada como una entidad 20-23, en lugar de como un grupo de estrechamente relacionados, pero distintos, las proteínas. La existencia y la persistencia de múltiples especies de IFN incluyendo los subtipos de IFN-α, durante la evolución de los vertebrados 24 sugiere que al menos un subconjunto de estos subtipos tienen funciones específicas o únicas. Es posible que los patrones que definen la expresión de IFN se descifrar y ayudar a caracterizar las funciones específicas de uno o más de los subtipos 17. El reto de estudiar tque escriba subtipos I y III IFN se basa en su identidad de secuencia compartida: los doce subtipos de IFN-α comparten> 50% 25 y los subtipos de IFN-λ comparten 81-96% 26 de sus secuencias de aminoácidos. En el ensayo de QRT-PCR descrito, baliza molecular (MB) y ácido nucleico bloqueado (LNA) sondas fluorescentes discriminan individuales diferencias de pares de bases entre las secuencias del subtipo IFN muy similares y permiten la caracterización de la firma la expresión de IFN. 384 pocillos formato de placa de El ensayo incluye tanto cuantitativos (normas de transcripción) y (los genes del hogar (HKG)) semi-cuantitativos medidas, lo que permite el análisis de número de copias de la transcripción y ΔCq respectivamente. Montaje de lotes, facilitado por pipeteo automatizado multicanal, y almacenamiento a largo plazo, es posible a través de secado de la imprimación / sonda (Pr / Pb) establece en las placas, mejorar la reproducibilidad, utilidad y practicidad del ensayo.
Este protocolo describe el procesopara la preparación de placas de 384 pocillos de ensayo QRT-PCR (Figura 1) con hasta diecisiete conjuntos Pr / Pb diferentes dirigidos subtipos de IFN humanos (Tabla 1). Pr / Pb conjunto de trabajo placas fuente de valores (Figura 2) se utilizan para preparar múltiples de 384 pocillos placas de ensayo en un proceso que puede ser automatizado usando una pipeta multicanal robótica. Mientras que el enfoque inicial fue en la creación de un protocolo para el estudio de firmas de expresión de IFN humanos, este método se ha aplicado a los macacos rhesus también. Aunque los diseños de placa son ligeramente diferentes y los conjuntos de Pr / Pb (Tabla 2) son distintos, el método de preparación general para la creación de las placas humanos y rhesus es idéntico. Con modificaciones mínimas del protocolo, el método puede ser ejecutado para permitir el desarrollo de ensayos para estudiar otros grupos de genes estrechamente relacionados.
Ver las figuras 1 y 2 Debajo
Véanse las Tablas 1 y 2 Belay
Este informe describe el diseño, la producción por lotes, y un enfoque hacia el análisis de un ensayo para medir la transcripción de un conjunto de genes muy similares en un laboratorio de investigación. El ensayo de alto rendimiento QRT-PCR informó aquí mide el IFN-y – subtipos λ con alta especificidad. Este método consiste en dos aspectos fundamentales, el diseño de conjuntos Pr / Pb que discriminan entre los miembros de una familia de genes homólogos y el desarrollo de una plataforma de producción para la creación de placas de ensayo de 384 pocillos fiables y coherentes precargados con los conjuntos Pr / Pb. Las sondas QRT-PCR incorporan una o química enfoque estructural (MB) (LNA) a mejorar su especificidad 29. Para dos de los conjuntos de cebadores en el ensayo de rhesus (Tabla 2), el sistema de mutación-amplificación refractaria (ARMS) fue incorporado en las secuencias de cebadores para mejorar aún más la especificidad 30. Aunque en general es mejor apuntar exón-exón cruces a ENHAna vez que la especificidad de una reacción QRT-PCR, esto no fue posible debido a que el IFN de tipo I genes carecen de intrones. Por lo tanto, el ADN genómico se amplifica en la reacción de PCR, y debe ser degradado por tratamiento con DNasa después de la extracción de ARN.
La región diana para los conjuntos de Pr / Pb se restringió a las regiones codificantes del péptido maduro para cada IFN. Debido a la alta similitud de secuencia entre los subtipos de IFN-α, en particular la región del péptido maduro, a veces era necesario comprometer la sensibilidad para garantizar la especificidad. Este fue especialmente el caso con IFN-α17, donde la transcripción péptido maduro tiene sólo cuatro bases únicas cuando se compara con los otros subtipos de IFN-α. Orientación de IFN-α17 cebadores que se unen las transcripciones de múltiples subtipos requiere, restringiendo especificidad a la sonda. Como consecuencia, la reacción de PCR amplificará subtipos distintos de IFN-α17, consumiendo de ese modo un porcentaje sustancial de los reactivos y loweri PCRng de la amplitud de la señal de fluorescencia de la sonda específica para IFN-α17. Un reto adicional hacia el diseño de conjuntos de Pr / Pb sensibles y específicos para los genes altamente similares, tales como el IFN es la posibilidad de que las secuencias anotado en la base de datos GenBank pueden no ser completa o completa en el momento del diseño. De nuevo, esto fue un reto para IFN-α17, en el que las secuencias recién anotado no se alinean perfectamente con la versión de la secuencia en la base de datos en el momento del diseño. Por lo tanto, al diseñar Pr / Pb establece para los genes que no han sido estudiados intensivamente, es aconsejable consultar periódicamente la última secuencia anotada de un gen diana. Finalmente, es necesario asegurarse de que los conjuntos de Pr / Pb no amplifican pseudogenes que pueden ser transcritas pero no traducidas.
Después de diseñar los decorados Pr / Pb, el siguiente reto es la optimización de las condiciones de la PCR de diecisiete diferentes Pr / Pb establece en una placa de 384 pocillos. Normas de transcripción son importante en la prueba de la especificidad de un conjunto Pr / Pb y convertido en esencial para la armonización de las condiciones de QRT-PCR de los numerosos y diferentes reacciones de PCR. Prueba de un conjunto Pr / Pb contra las normas de transcripción establece su eficiencia y sensibilidad; plásmidos que expresan pseudogenes muy similares pueden ser necesarias para asegurar que el Pr / Pb establecido mide selectivamente la transcripción del gen funcional. Las normas de transcripción también proporcionan un medio cuantitativo de análisis (número de transcripciones), además de los análisis semi-cuantitativo con respecto a un gen de mantenimiento (ΔCq).
Robotic pipeteo multicanal de una placa fuente de 96 pocillos en múltiples de 384 pocillos placas de ensayo mejora la precisión y consistencia de los resultados entre las placas. ADN de esperma de salmón (ssDNA) se utiliza como un portador que estabiliza y conserva los conjuntos de Pr / Pb para almacenamiento a largo plazo, al igual que el secado de los reactivos dispensados en las placas. El secado de las placas también disminuye el volumen de la reacciónnecesario para obtener resultados reproducibles, que a su vez conserva muestras preciosas y disminuye el uso de reactivos costosos. A través de estos pasos, los lotes de placas se ensamblan que proporcionan precisión y consistencia durante más de seis meses.
Después de la preparación de placas, las medidas de control de calidad son fundamentales para comprobar la consistencia de un lote de placas. Para este propósito, otros cuatro conjuntos de normas se ejecutan en un plato. La placa "estándar 5x" seguimiento del rendimiento y crea un conjunto de datos a la que se comparan los estándares de una placa individual. Mientras diez diluciones de 10 veces de cada estándar se utilizan durante el diseño del ensayo, las consideraciones de espacio requieren que cuatro puntos se utilizan para la curva estándar en cada placa de ensayo, y para la placa estándar de 5x. Además, un control positivo debe ser incluida en cada placa para garantizar la validez de la placa.
Normalmente, se tarda 3-4 horas para preparar seis placas de ensayo de un Pr / Pb splaca ource; es factible para preparar doce placas en un solo día en un laboratorio de investigación. Dado que cada placa de ensayo subtipo humano IFN examina diecisiete conjuntos Pr / Pb y puede acomodar quince muestras experimentales, un día de montaje produce un lote de placas con la capacidad de generar hasta 3060 puntos de datos experimentales. Los datos en bruto de la plataforma QRT-PCR pueden ser procesados y ensamblados mediante secuencias de comandos de programación en un software de hoja de cálculo para rellenar automáticamente una plantilla de análisis prediseñado. Este método minimiza manos en la entrada de datos, evitando así errores de copia y permite al investigador se centran en el análisis de datos en lugar de la recopilación de datos. Como se describe aquí, este ensayo de alto rendimiento QRT-PCR se puede aplicar para medir la expresión de los subtipos de interferón en las muestras de macaco rhesus y humano o se podría adaptar para utilizar para otras especies o conjuntos de genes homólogos. La flexibilidad de la disposición de la placa permite al usuario cambiar de cebador / sonda fija para adaptar los genes deinterés hacia un tipo de célula particular o sistema modelo. Este ensayo se puede aplicar para medir firmas de expresión de IFN en modelos de cultivo celular que estudian patógenos o en muestras de pacientes en el contexto de modelos de enfermedades para dilucidar los mecanismos de señalización implicadas en la respuesta inmune.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por CBER / FDA-NIAID / NIH Interinstitucional Acuerdo YI-AI-6153-01, FDA / CBER fondos intramuros, y la Iniciativa de contramedidas médicas FDA. TCT, MNB, VPM, LMS, y KDK fueron apoyados por una cita para el Programa de Participación de Investigación en el Centro de Evaluación e Investigación Biológica administrado por el Instituto Oak Ridge para la Educación la Ciencia a través de un acuerdo interinstitucional entre los EE.UU. Departmen de Energía y los EE.UU. Administración de Alimentos y Drogas.
0.2mL PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
12-channel Electronic Pipette, 5-250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |