High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Lynnsey A. Renn; Terence C. Theisen; Maria B. Navarro; Viraj P. Mane; Lynnsie M. Schramm; Kevin D. Kirschman; Giulia Fabozzi; Philippa Hillyer; Montserrat Puig; Daniela Verthelyi; Ronald L. Rabin

doi:10.3791/52650

JoVE Journal > Immunology and Infection

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İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Published: March 24, 2015

doi:

10.3791/52650

Lynnsey A. Renn¹, Terence C. Theisen¹, Maria B. Navarro¹, Viraj P. Mane¹, Lynnsie M. Schramm¹, Kevin D. Kirschman¹, Giulia Fabozzi¹, Philippa Hillyer¹, Montserrat Puig², Daniela Verthelyi², Ronald L. Rabin¹

¹Center for Biologics Evaluation and Research,US Food and Drug Administration, ²Center for Drug Evaluation and Research,US Food and Drug Administration

Özet

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Abstract

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

Introduction

Tipo I e III interferoni (IFN) sono fondamentali per la risposta immunitaria al virus e altri stimoli patogeni e presente in tutti i vertebrati ^1. Le cellule immunitarie e non immune esprimono e secernono, oltre che rispondere a, IFN ^2. Sensori immunitarie innate, come i recettori Toll-like (TLR), Sting, e RIG-I, inducono tipo I e di espressione III IFN al rilevamento dei modelli molecolari patogeni associati (PAMP) ^3,4. Negli esseri umani, di tipo I IFN includono IFN-β, -ω, -κ, e 12 sottotipi di IFN-α, e si legano al recettore IFNAR1 / IFNAR2 complesso ^2,5. Tipo IFN III includono IFN-λ1, -λ2, e -λ3 e legano al complesso recettoriale IL10RB / IL28RA ^2. Classicamente, tipo I e III IFN legano ai rispettivi complessi recettoriali che poi reclutano STAT1 / eterodimeri STAT2 e iniziare la trascrizione di interferone stimolato geni (ISG) ^6. ISG sono coinvolti in una vasta gamma di funzioni, dalla antivirali e antiattività proliferativa di attivazione della risposta immunitaria adattativa ^7.

I numerosi meccanismi patogeni si sono evoluti di eludere, sovvertire, e dirottare elementi della via di segnalazione IFN dimostrano l'importanza di IFN nella risposta immunitaria innata ^8. Ad esempio, il virus vaccinia esprime un recettore decoy con IFNAR1 omologia che sequestra tipo I IFN ^9, mentre un virus della malattia Yaba-come secerne una glicoproteina che inibisce I e III IFN proteine ¹⁰ tipo. Oltre al loro ruolo nella difesa dell'ospite, IFN sono anche implicati nella sorveglianza cancro e un certo numero di malattie auto-infiammatoria: silenziamento dell'espressione IFN in cellule di carcinoma mammario limita immunosorveglianza ^11, sovrapproduzione di IFN-α è un meccanismo per lo sviluppo di sistemica lupus eritematoso ^12, e l'attivazione errante di STING porta a infiammazione sistemica causata da una quantità eccessiva di IFN a vasculopatia STING-associato13. Terapeutico, IFN sono usati per trattare la sclerosi multipla ^14, infezioni virali croniche come HBV e HCV ^{15 16,17,} e tumori come leucemia a cellule capellute ¹⁸ e leucemia mieloide cronica ^19. Domande sulla rilevanza di IFN in un particolare processo fisiologico rivelano continuamente il carattere ubiquitario di questa famiglia delle citochine.

Tipo I IFN, soprattutto i sottotipi IFN-α, sono spesso considerati come un'unica entità ^20-23, piuttosto che come un gruppo di strettamente correlati, ma distinti, le proteine. L'esistenza e la persistenza di molteplici specie IFN inclusi i sottotipi IFN-α, nel corso dell'evoluzione dei vertebrati ²⁴ suggerisce che almeno un sottoinsieme di questi sottotipi hanno funzioni specifiche o esclusive. È possibile che definiscono pattern di espressione IFN saranno decifrare e contribuire caratterizzano le funzioni specifiche di uno o più dei sottotipi ^17. La sfida di studiare tegli tipo sottotipi I e III IFN si basa sulla loro identità sequenza condivisa: i dodici sottotipi IFN-α condividono> 50% ²⁵ e sottotipi IFN-λ condividono 81-96% ²⁶ delle loro sequenze di aminoacidi. Nel descritto test qRT-PCR, faro molecolare (MB) e l'acido nucleico bloccato (LNA) sonde fluorescenti discriminano singole differenze coppie di basi tra le sequenze molto simili IFN sottotipo e consentono la caratterizzazione della firma espressione IFN. 384-ben formato piatto del test comprende sia gli standard (trascrizione) e quantitativi (i geni housekeeping (HKG)) semi-quantitative misure, consentendo l'analisi in base al numero di copia e trascrizione ΔCq rispettivamente. Montaggio Batch, facilitato pipettando automatizzati multicanale, e la conservazione a lungo termine, possibile attraverso l'asciugatura del primer / sonda (Pr / Pb) imposta sulle piastre, migliorare la riproducibilità, utilità e la praticità del test.

Questo protocollo descrive il processoper la preparazione di piatti a 384 pozzetti test qRT-PCR (Figura 1) con un massimo di diciassette diversi set Pr / Pb di targeting sottotipi IFN umani (Tabella 1). Pr / Pb set di lavoro piastre stock di origine (Figura 2) vengono utilizzati per la preparazione di più 384 pozzetti piastre saggio in un processo che può essere automatizzato usando una pipetta multicanale robotico. Mentre l'attenzione iniziale era sulla creazione di un protocollo per studiare firme espressione IFN umani, questo metodo è stato applicato a macachi rhesus pure. Sebbene i layout piastra sono leggermente diverse e gli insiemi Pr / Pb (Tabella 2) sono distinti, il metodo di preparazione complessivo per creare le piastre umani e rhesus è identico. Con modifiche minime del protocollo, il metodo può essere eseguito per consentire lo sviluppo di saggi per studiare altri gruppi di geni strettamente correlati.

Vedi figure 1 e 2 qui sotto

Vedi tabelle 1 e 2 Below

Protocol

1. Preparazione delle Diluizioni Seriali standard (Figura 3A) NOTA: Serie Serial diluizione dei plasmidi linearizzati contenenti le sequenze mirate da un insieme Pr / Pb sono utilizzati come standard quantitativi per l'analisi qRT-PCR. Ogni set di diluizione seriale standard per i sottotipi IFN contiene un volume sufficiente per eseguire 90 piastre test. I quattro punti della curva di diluizione standard utilizzato per il saggio sono selezionati per coprire valori Ct da una gamma da 20 a 32 (Tabella 3). Thaw, vortex e centrifugare brevemente la standard (50 pm) e il salmone DNA dello sperma (ssDNA, 10 mg / ml) soluzioni stock. Preparare la miscela ssDNA / acqua per 17 insiemi diluizione standard miscelando 51 ml di ssDNA con 20,3 ml di acqua. Etichettare un 8-tubo PCR strip per un set diluizione standard. NOTA: La preparazione delle diluizioni seriali standard delle soluzioni madre avrà 2-3 ore. Dispensare 190 microlitri della miscela ssDNA / acqua alla ftubo IRST nella striscia e 180 ml di ssDNA mix / acqua ai cinque tubi rimanenti. Eseguire una diluizione 1:20 trasferendo 10 ml dal ceppo standard di 50 PM per il tubo con 190 ml di ssDNA / acqua, mescolare; vortex e rapidamente si centrifuga la striscia PCR. Eseguire una diluizione 1:10 trasferendo 20 microlitri dal tubo più recente diluito al successivo tubo nella serie; vortex e rapidamente si centrifuga la striscia PCR. Ripetere il punto 1.6 fino all'ultimo tubo nella serie di diluizioni ha ricevuto lo standard. Ripetere i passaggi 1,3-1,7 per ogni standard. Vedere tabella 3 2. Preparazione di Primer / Probe (Pr / Pb) e No Control Template (NTC) di funzionamento Stock Mixes (Figura 3B) NOTA: ogni 1,7 ml Pr / Pb set stock e 128,6 ml nessun controllo Template (NTC) che lavorano magazzino mix farà 30 piastre saggio lavorare. Preparare il Pr / Pb set mix azionari di lavoro. NONE: Preparazione del set Pr / Pb e NTC lavoro stock mescola dalle soluzioni madre avrà 2-3 ore. Risospendere i primer e le sonde a 100 micron con acqua ultra-pura per la preparazione delle soluzioni madre. Etichetta fino a diciassette 2 tubi ml; uno per ogni set Pr / Pb inclusi nel test. Thaw, vortex e centrifugare brevemente i primer (100 micron), sonde (100 micron), e ssDNA (10 mg / ml) soluzioni stock. Aggiungere 2 ml di ssDNA ad ogni tubo con il 12,5 microlitri pipetta multicanale elettronica. Aggiungere il primer in avanti del caso, indietro primer e sonda per ogni Pr / Pb set di lavoro stock tubo. Vedi Tabella 1 per i set di Pr / Pb di targeting sottotipi IFN umani e Tabella 2 per il macaco rhesus insiemi Pr / Pb. Aggiungere acqua per portare il volume di ogni Pr / Pb set di lavoro stock tubo di 200 ml. NOTA: Il volume di primer, sonde e acqua da aggiungere dipende dalla concentrazione di reazione finale richiesto un Pr / Pbset. Preparare le miscele azionari NTC di lavoro. Label due strisce PCR 5 tubi per gli stock di lavoro NTC mescola. Trasferimento 14.3 ml di ogni Pr / Pb impostati al tubo di lavoro stock adeguato mix NTC. Vedere la Tabella 4 per i set di combinazioni di Pr / Pb per pozzi NTC. Aggiungere acqua a ciascuna delle azioni di lavoro NTC mescola per portare il volume finale a 128,6 ml. Vortex, centrifugare brevemente, e posizionare i tubi al buio in ghiaccio oa -20 ° C per la conservazione a lungo termine. Vedere tabella 4 Diluire il Pr / Pb set scorte di lavoro. Dopo la rimozione di una aliquota dei set Pr / Pb necessari per le miscele Stock Working NTC, aggiungere 1,5 ml di acqua per portare il volume finale di ogni Pr / Pb set di lavoro stock tubo di 1,7 ml. Vortex, centrifugare brevemente, e posizionare i tubi al buio in ghiaccio oa -20 ° C per la conservazione a lungo termine. <pclass > 3. Preparazione delle lastre test 384 e utilizzando la pipetta multicanale automatizzata Preparare un piatto di origine a 96 pozzetti dei set Pr / Pb e miscele NTC per aliquotando a 384 pozzetti piastre test. NOTA: La preparazione del piatto di origine dalle Pr / Pb mix funzionamento azionari avrà meno di 1 ora. Ogni piatto fonte 96-bene è abbastanza per fare sei piastre test 384 pozzetti (Figura 3C). Vortex e centrifugare brevemente il Pr / Pb set scorte di lavoro e NTC mix azionari di lavoro. Posizionare una nuova piastra a 96 pozzetti in un blocco a 96 pozzetti di raffreddamento refrigerati e designare i pozzetti per ogni set Pr / Pb o NTC mescolare i pozzetti ricevono (vedi figura 2). Aggiungere acqua alla piastra a 96 pozzetti con una pipetta multicanale 250 microlitri elettronica: Versare 66 ml di acqua per ogni Pr / Pb impostato bene (tranne i 4 pozzi per Target 17). Dispensare 82,5 ml di acqua per i 4 target 17 pozzi. Dispensare 27,5 ml di acqua per ogni mix NTC bene. </li> Aggiungere il corretto Pr / Pb set stock lavorando ai pozzetti designate della piastra a 96 pozzetti: Dispensare 54 ml di corretta Pr / Pb set stock lavorando al set designati pozzi Pr / Pb (tranne i 4 pozzi per Target 17). Dispensare 67,5 ml di destinazione 17 Pr / Pb set stock di lavoro per i designati target 17 Pr / Pb set pozzi. Aggiungere 22,5 ml di corretta NTC lavoro stock mix nei pozzetti designati. Sigillare la piastra a 96 pozzetti con una guarnizione adesiva piastra e centrifugare per 1 min a 700 xg per garantire i contenuti sono al fondo dei pozzetti. Posizionare la piastra a 96 pozzetti nel vortex con un adattatore piastra a 96 pozzetti e mescolare per 1 min a 1.000 giri al minuto. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti per 5 min a 700 x g. Conservare la piastra a 96 pozzetti fonte al buio a 4 ° C se si utilizza lo stesso giorno, altrimenti conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Preparare le piastre test 384-bene aggiungendo il Pr / Pb insiemi utilizzando la pipetta multicanale automatizzata. NOTA: La preparazione di sei piatti test dalla piastra sorgente a 96 pozzetti avrà 3-4 ore. Prima di effettuare piastre, pre-raffreddare il nido raffreddamento a 4 ° C e pre-riscaldare la piastra evaporatore a 125 ° C e il blocco di calore inferiore a 80 ° C con un flusso d'aria che soffia tra 20-25 litri al minuto (LPM). Accendere la pipetta multicanale automatizzata e aprire il protocollo per la fabbricazione di piastre test IFN facendo doppio clic sull'icona del software. Per impostare la piattaforma, posizionare una scatola completamente pieno puntale in posizione piattaforma 1, la piastra di fonte a 96 pozzetti in posizione 4, e una nuova piastra a 384 pozzetti in posizione 6. Inizia la corsa premendo il tasto play. NOTA: Al termine di un percorso, ogni pozzetto conterrà 5 ml di mix Pr / Pb. NOTA: L'importo finale di ssDNA aggiunto per pozzetto della piastra a 384 pozzetti test è 0.025 mg. Agitare gentilmente la piastra di dosaggio 384 pozzetti su una superficie piana per assicurare fluidi sono in fondo dei pozzetti e applicare un adesivoguarnizione della piastra. Centrifugare la piastra per 1 min a 700 x g. Rimuovere la guarnizione della piastra adesiva, posizionare la piastra a 384 pozzetti test in asciugatrice piastra e posizionare il collettore 384 pozzetti direttamente sopra i pozzi. Quando il contenuto del piatto 384 pozzetti test asciutto, applicare una nuova guarnizione piastra adesiva, avvolgere in un foglio, etichetta, e conservare al buio a 4 ° C fino al momento dell'uso. NOTA: Le piastre possono essere conservati a 4 ° C per almeno 6 mesi. Ripetere 3.2.3-3.2.6 fino 6 x 384 pozzetti piastre test sono preparati o il liquido nella piastra sorgente a 96 pozzetti è esaurito. Spegnere il nido di raffreddamento, chiudere il software, e spegnere la pipetta multicanale automatizzata. Spegnere l'asciugatrice piatto. 4. Caricamento ed esecuzione di un piatto 384 pozzetti Assay Preparare due gene housekeeping (HKG) e miscele, che consistono del set Pr / Pb di HKG, ssDNA, PCR master mix, e acqua, da aggiungere ad una piastra a 384 pozzetti test essiccati ( <strong> Figura 3D). NOTA: La preparazione delle miscele e caricare la piastra test avrà 1-2 ore. L'esecuzione del piatto test richiederà meno di 2 ore. Etichettare una provetta da 1,5 ml per ogni mix HKG. Diluire 2 ml di ssDNA (10 mg / ml), con 84,9 ml di acqua. Aggiungere 2 ml di ssDNA diluito, 11.8 ml di acqua, 23 ml di master mix, e 9.2 ml di corretta 20x HKG Pr / Pr impostato ogni provetta, vortice, e centrifugare brevemente. Utilizzare deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GAPDH) e ubiquitina C (UBC) come HKG per il dosaggio umana (vedi Materiali Tabella). Utilizzare GAPDH e 18S ribosomiale RNA come HKG per il saggio rhesus. NOTA: Il HKG utilizzato per eseguire il test sono flessibili e dovrebbe riflettere i geni appropriati per il tipo di cellule in fase di test GAPDH, UBC, e 18S sono esempi di uso comune HKG;. altro HKG può essere più appropriato. Preparare il campione e positive controllare ben miscele, che consistono di campione o di cDNA di controllo positivo, master mix e acqua, da aggiungere ad una piastra a 384 pozzetti test essiccato. Preparare il campione e le miscele di controllo positivi in quantità sufficiente a dispensare a 21 pozzetti della piastra (Figura 3D). Prima della sintesi del DNA, seguire le istruzioni del produttore per preparare i campioni di RNA con un passo DNasi digestione. Preparare i campioni e controllo positivo in anticipo dalla sintesi cDNA di almeno 500 ng di RNA seguita da trattamento con RNasi H (volume finale di 24 microlitri di ciascun campione) seguendo le istruzioni del produttore. Conservare il cDNA preparata a -20 ° C fino al momento dell'uso. Thaw, vortex e centrifugare brevemente il cDNA campione. Aggiungere 78,8 ml di master mix e 54,8 ml di acqua per ogni campione 24 ml e tubo controllo positivo. Vortex e centrifugare brevemente le provette. Preparare gli standard e NTC mescola bene, conCONSISTONO di master mix e acqua, da aggiungere a una 384-pozzetti test secchi (Figura 3D). Per gli standard ben mescolare, aggiungere 165 ml di acqua a 275 ml di master mix in una provetta da 1,5 ml. Per la NTC bene mescolare, aggiungere 52,5 ml di acqua per 52,5 ml di master mix in una provetta da 1,5 ml. Vortex e centrifugare brevemente le provette. Preparare una piastra test 384 pozzetti secchi per il caricamento delle miscele e campioni. Rimuovere un essiccata piastra a 384 pozzetti dosaggio da 4 ° C e centrifugare per 1 min a 700 x g. Posizionare la piastra su un blocco di 384 pozzetti di raffreddamento raffreddato, rimuovere la guarnizione della piastra adesiva e delineare i pozzetti della piastra per designare dove le varie miscele e campioni verranno pipettati (Figura 1). Caricare la piastra a 384 pozzetti test con mix ben standard standard, NTC ben mescolare, campioni, controllo positivo, e mix HKG (Figura 3E). Vortex e centrifugare brevemente tutte le soluzioni prima di dispensare al piatto. Dispensare 6 ml degli standard ben si mescolano in ogni pozzetto standard con 30 microlitri elettronica pipetta multicanale. Dispensare 1,5 ml di diluizione seriale standard corretto e designato con il 12,5 microlitri pipetta multicanale elettronica. Dispensare 7,5 ml di NTC ben si mescolano a ciascun NTC bene con il 30 microlitri elettronica pipetta multicanale. Dispensare 7,5 ml di campioni nei pozzetti designati con 30 microlitri pipetta multicanale elettronica. Dispensare 2,5 ml di HKG Pr / Pb mescola ai pozzetti designati con il 12,5 microlitri pipetta multicanale elettronica. Riempire i pozzetti vuoti con 7,5 ml di acqua e di master mix miscela rimasto con il 30 microlitri multicanale elettronica pipetta; 7,5 ml di acqua da sola anche lavorare. Sigillare la piastra a 384 pozzetti test con la pellicola adesiva ottica e centrifugare per 1 min a 700 x g. Vortex la piastra a 384 pozzetti sigillati nel vortex per 2 min a 2.600 rpme centrifugare per 5 min a 700 x g. Posizionare la piastra di test 384-ben chiuso nella macchina qRT-PCR, aprire il modello per il layout del test e iniziare la corsa. NOTA: I risultati possono essere esportati come un foglio di calcolo o come file di testo per l'analisi. Utilizzare le seguenti condizioni ottimali di reazione termociclatore per il test: i) 50 ° C per 2 min, ii) 95 ° C per 10 min, iii) 95 ° C per 25 s, iv) 59 ° C per 1 min. Ripetere i punti iii e iv per 40 cicli. Esportare i dati grezzi dalla piattaforma qRT-PCR in un software foglio di calcolo. Tracciare ogni standard 4 set point come una curva standard per osservare linearità. Eseguire l'analisi calcolando il ΔCq o per numero di copie in base ai quattro punti di curve standard 27. Vedi Figura 3 Sotto

Representative Results

Il saggio qRT-PCR descritto può essere implementato per analizzare pattern di espressione di tipo I e III IFN in una varietà di tipi di cellule e contesti. Ad esempio, di tipo I umano e III IFN firme di espressione sono stati analizzati nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da 6 donatori stimolate con ligandi TLR; poli I: C (25 mcg / ml), LPS (10 ng / ml), imiquimod (10 mM), e oligonucleotidi CpG (1 mM) (Figura 4). I dati sono stati analizzati utilizzando un software foglio di calcolo e presentati come grafici radar con i sottotipi IFN-α disposte in senso orario secondo l'albero filogenetico della loro sequenza proteica 27. I grafici radar di espressione IFN umano sono presentati in una scala logaritmica calcolato utilizzando i due diversi metodi di analisi incorporato nel design dosaggio: valore assoluto Cq normalizzato a HKG (ΔCq), e copiare il numero di template per microgrammo (mcg) di RNA totale . I valori del numero di copie sono calcolati dai risultati o curva standard di trascrizione fa. I dati mostrano che le firme di espressione IFN umani indotte da agonisti TLR sono ligando specifico. Vedere la Figura 4 Sotto Come dimostrato per le firme di espressione IFN umani, le firme di espressione di tipo I e III IFN in macachi rhesus erano anche TLR ligando specifico. PBMC da 3 donatori sono state stimolate con poli I: C (50 mcg / ml), LPS (10 mg / ml), e imiquimod (10 ug / ml) per 3 ore (Figura 5). Espressione sottotipo IFN in cellule non stimolate al basale è stata bassa. Un numero limitato di IFN sottotipi sono state espresse in risposta a LPS e poli I: C. In contrasto, l'espressione di IFN in risposta a imiquimod era alta e l'espressione sottotipo era ampia. L'espressione di IFN-β e IFN-λ1 si arricchisce di tutti e tre TLR agonisti 28. Vedere la Figura 5 Sotto sempre "> Figura 1:. Il layout per un piatto 384 pozzetti test con diciassette insiemi Pr / Pb Obiettivo numero si riferisce a un insieme Pr / Pb. Le curve standard a quattro punti (triangolo grigio scuro) vengono aggiunti alle colonne 1-5. I set HKG Pr / Pb (sfondo bianco) si aggiungono alle colonne 6 e 7. Le colonne, 8-24, sono specifici per una delle diciassette insiemi Pr / Pb. I campioni vengono aggiunti alle righe AP, da colonne 6-24 (frecce nere). I due pozzi (O5, P5) nella parte inferiore della colonna 5 ricevono solo acqua e master mix. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2:. Il layout per un piatto di origine a 96 pozzetti con diciassette insiemi Pr / Pb numero di destinazione si riferisce ad un Pr / Pbset. Frecce nere rappresentano quando si aggiunge un insieme Pr / Pb a più pozzi. Miscele NTC sono aggiunti ai pozzetti designati (sfondo grigio scuro). I due pozzi (F3, G3) con linee diagonali sono inutilizzati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3: Schema di interventi specifici nel protocollo del test qRT-PCR schema AE selezionano parti del protocollo.. (A) Fase 1: Preparazione di diluizioni seriali standard. (B) Fase 2: Preparazione di Pr / Pb e NTC mix azionari di lavoro. (C) Fase 3.1: Preparazione di un scorte piastra a 96 pozzetti di lavoro degli insiemi Pr / Pb e miscele NTC. (D) Fase 4,1-3: Preparazione delle miscele per caricare la piastra a 384 pozzetti test. (Estep 4.5: Caricare la piastra a 384 pozzetti test. I diagrammi sono lette dall'alto a sinistra verso l'angolo in basso a destra. Reagenti per l'interferone (IFN) test vengono conservati a -20 ° C e sono elencati nella colonna di sinistra; Linee azioni distinte nel protocollo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4: La firma espressione IFN umano in cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) differisce in risposta ai ligandi TLR utilizzati per la stimolazione PBMC sono state stimolate con ligandi TLR e RNA è stato raccolto per l'analisi qRT-PCR.. Le medie geometriche delle risposte di picco Poly I: C (25 mg / ml) a 8 ore (quadrati rossi), LPS (10 ng / ml) a 4 ore (triangoli verdi), Imiquimod (10 micron) a 16 ore ( diamanti viola), CpG (1 um) a16 ore (cerchi neri), e controllo non stimolata a 16 ore (cerchi blu) da 6 donatori sono mostrati in scala logaritmica 10 in funzione di espressione del HKG UBC ΔCq (sinistra) o come numero di copie per ogni mg di RNA (a destra) . Sottotipi IFN-α sono ordinate in base alla trama filogenetica della sequenza aminoacidica somiglianza. Questo dato è stato originariamente pubblicato in Immunology and Cell Biology 27. Figura 5:. Il macaco rhesus IFN firma espressione nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) è diversa in risposta ai ligandi TLR utilizzati per la stimolazione PBMC da tre macachi Rhesus (designati dalla piazza, il diamante, e il triangolo) sono stati isolati dal sangue intero e stimolati con lipopolisaccaride (LPS) (10 mcg / ml), poli I: C (50 mcg / ml) o imiquimod (10 mcg / ml). Le cellule sono state raccolte a 0 ore (OPEn forme) o dopo 3 ore di stimolazione TLR (forme chiuse) per la misura dell'espressione IFN. Livelli di trascritto di tipo I, II, e III IFN sono visualizzate in scala logaritmica 10 in funzione di espressione del HKG GAPDH ΔCq (sinistra) o come numero di copia / mg RNA (a destra). Questo dato è stato originariamente pubblicato nel Journal of Interferon e citochine ricerca 28. Tabella 1:. IFN umano Primer / sonda sequenze set e la reazione informazioni Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella. Tabella 2:. Macaco Rhesus IFN Primer / sonda sequenze set e la reazione informazioni Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella. Concentrazione plasmidi (FM) La B C D IFN-α1 25 2.5 0.25 0,025 IFN-α2 25 2.5 0.25 0,025 IFN-α4 2500 250 25 2.5 IFN-α5 25 2.5 0.25 0,025 IFN-α6 250 25 2.5 0.25 IFN-α7 250 25 2.5 0.25 IFN-α8 250 25 2.5 0.25 IFN-α10 25 2.5 0.25 0,025 IFN-α14 25 2.5 0.25 0,025 IFN-α16 250 25 2.5 0.25 IFN-α17 25 2.5 0.25 0,025 IFN-α21 25 2.5 0.25 0,025 IFN-λ1 25 2.5 0.25 0,025 IFN-λ2 25 2.5 0.25 0,025 IFN-λ3 250 25 2.5 0.25 IFN-β 25 2.5 0.25 0,025 IFN-ω 250 25 2.5 0.25 Tabella 3: Standard set diluizione informazioni concentrazione. IFN Pr / Pb Sets aggiunti Volume dell'acqua aggiunta (ml) NTC 1 IFN-β, -ω, -λ3 85,7 NTC 2 IFN-α1, -α5 100.0 NTC 3 IFN-α2 114.3 NTC 4 IFN-α4 114.3 NTC 5 IFN-α7 114.3 NTC 6 IFN-α6, -α8, -α10 85,7 NTC 7 IFN-α14, -α16 100.0 NTC 8 IFN-α17 114.3 NTC 9 IFN-α21, -λ1 100.0 NTC 10 IFN-λ2 114.3 Tabella 4: NTC magazzino lavora mescola informazioni.

Discussion

Tale relazione descrive la progettazione, produzione in lotti, e un approccio verso l'analisi di un test per misurare la trascrizione di una serie di geni molto simili in laboratorio di ricerca. Il test high-throughput qRT-PCR qui riportato misura la IFN-e – sottotipi λ con alta specificità. Questo metodo comporta due aspetti fondamentali, la progettazione di insiemi Pr / Pb che discriminano tra i membri di una famiglia di geni omologhi e lo sviluppo di una piattaforma di produzione per la realizzazione di lastre test 384 e affidabili e coerenti precaricati con i set di Pr / Pb. Le sonde qRT-PCR incorporano un (MB) o chimica (LNA) approccio strutturale verso il rafforzamento della loro specificità ^29. Per due dei set di primer nel test rhesus (Tabella 2), il sistema di amplificazione mutazione refrattaria (ARMS) è stato incorporato nelle sequenze dei primer per migliorare ulteriormente la specificità ^30. Mentre è generalmente meglio indirizzare giunzioni esone-esone a li esalta con gnce la specificità di una reazione qRT-PCR, questo non era possibile, perché il tipo di IFN geni mancano introni. Pertanto, il DNA genomico sarà amplificato nella reazione PCR, e deve essere degradata mediante trattamento DNasi dopo l'estrazione di RNA.

La regione di destinazione per i set di Pr / Pb è stata limitata alle regioni codificanti del peptide maturo per ogni IFN. A causa della alta somiglianza di sequenza tra i sottotipi di IFN-α, in particolare la regione peptide maturo, a volte era necessario compromettere sensibilità per garantire la specificità. Ciò è avvenuto in particolare con IFN-α17, dove il peptide trascrizione matura ha solo quattro basi uniche quando confrontato con gli altri sottotipi IFN-α. Targeting IFN-α17 richiede primer che legano le trascrizioni delle più sottotipi, limitando la specificità alla sonda. Di conseguenza, la reazione PCR amplifica sottotipi diversi IFN-α17, consumando quindi una percentuale sostanziale dei reagenti PCR e lowering l'ampiezza del segnale di fluorescenza della sonda specifica per IFN-α17. Un'ulteriore sfida verso la progettazione di insiemi Pr / Pb sensibili e specifici per i geni molto simili, come l'IFN è la possibilità che le sequenze annotati nel database GenBank potrebbero non essere completa o completa al momento della progettazione. Ancora una volta, questo era una sfida per IFN-α17, in cui le sequenze di recente annotati non si allineano perfettamente con la versione della sequenza del database al momento della progettazione. Pertanto, quando si progetta Pr / Pb imposta per i geni che non sono state intensamente studiate, è consigliabile controllare periodicamente l'ultima sequenza ragionata di un gene bersaglio. Infine, è necessario garantire che gli insiemi Pr / Pb non amplificano pseudogenes che possono essere trascritti ma non tradotte.

Dopo aver disegnato i set Pr / Pb, la prossima sfida è l'ottimizzazione delle condizioni di PCR di diciassette diverse Pr / Pb imposta su una piastra a 384 pozzetti. Norme Transcript sono important a testare la specificità di un insieme Pr / Pb e diventare indispensabile per armonizzare le condizioni qRT-PCR delle numerose reazioni PCR diverse. Test di un set Pr / Pb contro le norme di trascrizione stabilisce la sua efficienza e la sensibilità; plasmidi che esprimono pseudogeni molto simili possono essere necessarie per assicurare che il Pr / Pb set misura selettivamente la trascrizione del gene funzionale. Gli standard trascrizione fornisce anche un mezzo di analisi quantitativi (numero di trascritti), in aggiunta all'analisi semi-quantitativa rispetto ad un gene housekeeping (ΔCq).

Robotic pipettaggio multicanale da una piastra di fonte a 96 pozzetti in più 384 pozzetti piastre test migliora la precisione e la coerenza dei risultati tra le piastre. DNA di sperma di salmone (ssDNA) viene utilizzato come vettore che stabilizza e conserva i set Pr / Pb di stoccaggio a lungo termine, come fa essiccamento dei reagenti erogate nelle piastre. Essiccazione le piastre diminuisce anche il volume della reazionenecessaria per ottenere risultati riproducibili, che a sua volta conserva preziosi campioni e diminuisce l'uso di reagenti costosi. Attraverso questi passaggi, lotti di piastre sono montate che forniscono precisione e coerenza per più di sei mesi.

Dopo la preparazione piatto, le misure di controllo di qualità sono fondamentali per verificare la coerenza di un lotto di piastre. A questo scopo, un ulteriore quattro serie di norme vengono eseguiti su una piastra. La piastra "standard 5x" tiene traccia delle prestazioni e crea un set di dati a cui gli standard di un piatto individuale vengono confrontati. Mentre dieci diluizioni di 10 volte di ciascuno standard vengono utilizzati durante la progettazione dosaggio, considerazioni di spazio richiedono che quattro punti sono usati per la curva standard su ciascuna piastra di dosaggio e per la piastra standard 5x. Inoltre, un controllo positivo dovrebbe essere inclusa su ciascuna piastra per garantire la validità della piastra.

In genere, ci vogliono 3-4 ore per preparare sei piastre test da un Pr / Pb sPiastra ource; è fattibile preparare dodici piastre in un solo giorno in un laboratorio di ricerca. Poiché ogni piastra di dosaggio sottotipo IFN umano esamina diciassette insiemi Pr / Pb e può ospitare quindici campioni sperimentali, un giorno di assemblaggio produce un lotto di piastre con la capacità di generare fino a 3.060 punti dati sperimentali. I dati grezzi dalla piattaforma qRT-PCR possono essere elaborati e assemblati utilizzando script di programmazione in un software foglio di calcolo per compilare automaticamente un modello di analisi predefinito. Questo metodo riduce hands-on di inserimento dati, impedendo in tal modo errori di copiatura e consente al ricercatore di concentrarsi sull'analisi dei dati piuttosto che l'assemblaggio dei dati. Come descritto qui, questa alta produttività assay qRT-PCR può essere applicato per misurare l'espressione di sottotipi di interferone in campioni macaco rhesus e umana o potrebbe essere adattato da utilizzare per altre specie o insiemi di geni omologhi. La flessibilità del layout di piastra permette all'utente di cambiare fondo / probe imposta per adattare i geni diinteresse verso un particolare tipo di cellula o sistema modello. Questo test può essere applicato per misurare IFN firme di espressione in modelli di coltura cellulare che studiano agenti patogeni o nei campioni di pazienti nel contesto di modelli di malattia per chiarire i meccanismi di segnalazione coinvolti nella risposta immunitaria.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency accordo YI-AI-6153-01, FDA / CBER fondi intramurali, e la FDA contromisure mediche Initiative. TCT, MNB, VPM, LMS, e KDK sono stati sostenuti da un appuntamento al Programma Partecipazione di ricerca presso il Centro di Valutazione e Ricerca Biologics amministrato dal Ridge Institute Oak per l'educazione scientifica attraverso un accordo tra gli Stati Uniti Interagency Departmen dell'Energia e degli Stati Uniti Food and Drug Administration.

Materials


0.2mL PCR Tube Strips	Eppendorf (Westbury, NY, USA)	E0030 124 286
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-139	*Discontinued
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-137	*Discontinued
12-channel Electronic Pipette, 5-250uL	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-118	*Discontinued
2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile	Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)	229446
8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-115	*Discontinued
Disposable Reagent Reservoirs	VWR International (Radnor, PA, USA)	89094-668	25mL reservoirs with 2 dividers
E-Centrifuge	Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)	1090003
Eukaryotic 18S rRNA (18S)	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	Hs99999901_s1	Rhesus HKG Primer/probe set
Fixed Speed Mini Vortexer	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	02-215-360
Gas Permeable Adhesive Plate Seal	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	AB-0580	Disposable plate seal used during the plate preparation process
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)	FBR (Silver Spring, MD, USA)	Custom Order	Human HKG Primer/probe set
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	Rh02621745_g1	Rhesus HKG Primer/probe set
Hudson Solo automated multichannel pipettor	Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)	800200	Modified with a 384-well cooling nest
Linearized plasmids (IFN genes)	Aldevron (Fargo, ND, USA)	Custom Order	Item 3000, 3580; used for assay standards
LNA inhibitors	Exiqon (Woburn, MA, USA)	Custom Order	Item 500100
LNA Probes	Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)	Custom Order	Material number VC00023
Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-193
Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-196
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-160
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-152
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	4309849
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	N8010560
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	4311971	Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run
Microsoft Excel 2010 Spreadsheet	Microsoft (Redmond, WA, USA)	Office 2010	Visual Basic programming language
MixMate Vortex Mixer	Eppendorf (Westbury, NY, USA)	5353 000.014	2 dimensional plate vortex apparatus
Molecular Beacon Probes	FBR (Silver Spring, MD, USA)	Custom Order
PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes	Eppendorf (Westbury, NY, USA)	Z606634-1EA
Plate Dryer (manifold)	Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA)	Custom Order
Primer sets	FBR (Silver Spring, MD, USA)	Custom Order
pUC57 plasmid DNA	Genescript (Piscataway, NJ, USA)	SD1176
Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes	Life Technologies (Grand Island, NY, USA)	AM12400
RNase-free DNase Set (50)	Qiagen (Valencia, CA, USA)	79254
RNase H	New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)	M0297L
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen (Valencia, CA, USA)	74106
Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips)	Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)	800350-S
Salmon Sperm DNA Solution	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	15632-011
SoftLinx Version V	Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)	Custom Order	Software for programming pipetting steps
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG	Life Technologies (Grand Island, NY, USA)	4352042
ABgene Adhesive Plate Seals	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	AB0580
Ubiquitin C (UBC)	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	Hs01871556_s1	Human HKG Primer/probe set
Verso cDNA synthesis Kit	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	AB1453B
ViiA 7 Real-Time PCR System	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	4453536
Water-Ultra Pure	Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)	351-029-101
Zipvap 384 (plate dryer heating element)	Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)	384-109A	Plate Dryer

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QRT-PCR Interferon Subtypes Type I Interferons Type III Interferons LNA Probes Molecular Beacon Probes Transcript Standards Automated Pipetting Plate Drying Gene Expression Profiling

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Renn, L. A., Theisen, T. C., Navarro, M. B., Mane, V. P., Schramm, L. M., Kirschman, K. D., Fabozzi, G., Hillyer, P., Puig, M., Verthelyi, D., Rabin, R. L. High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes. J. Vis. Exp. (97), e52650, doi:10.3791/52650 (2015).