높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는
Özet
This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.
Abstract
Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.
Introduction
유형 I과 III 인터페론 (IFN)는 모든 척추 동물 1 바이러스 및 기타 병원성 자극와 현재에 대한 면역 반응에 중요하다. 면역 및 비 면역 세포가 응답, IFN이뿐만 아니라, 표현하고 분비한다. 이러한 수신자 같은 수용체 (TLR), 스팅, 그리고 RIG-I 등의 선천성 면역 센서는 병원체 관련 분자 패턴 (PAMP) 3,4 탐지시 타입 I과 III IFN 발현을 유도한다. 인간에서, 내가 IFN 유형은 2,5 복잡한 IFNAR-1 / IFNAR2 수용체에 IFN-β, -ω, -κ 및 IFN-α의 12 하위 유형 및 바인딩을 포함한다. 유형 III IFN은 IFN-λ1, -λ2 및 -λ3을 포함하고 IL10RB / IL28RA 수용체 복합체 (2)에 결합한다. 클래식, 유형 I과 III IFN 다음 STAT1 / STAT2 이종를 모집하고 인터페론 자극 유전자 (ISG) 6의 전사를 시작 각각의 수용체 복합체에 결합한다. ISG 항 바이러스 및 항에서, 함수의 다양한 범위에 관여적응 면역 반응 (7)의 활성화에 증식 활동.
병원체가 회피 파괴 및 IFN 시그널링 경로의 요소를 하이재킹 진화 수많은 메카니즘은 선천성 면역 반응 8 IFN의 중요성을 보여준다. 예를 들어, 우두 바이러스는 야바 같은 질병 바이러스가 I과 III IFN 단백질 (10)를 입력 억제하는 당 단백질을 분비하는 동안 9 IFN 입력 담즙산이 IFNAR-동성와 미끼 수용체를 표현한다. 숙주 방어에서의 역할 외에, IFN 또한 암 감시 및 자동 염증성 질환의 숫자에 연루 유방암 세포에서 IFN의 발현을 사일런 싱 immunosurveillance (11)을 제한, IFN-α의 과잉 생산은 전신의 개발기구는 홍 반성 루푸스 (12), 및 STING의 잘못된 활성화 STING 관련 혈관에 IFN 과도한 양으로 인한 전신 염증에 이르게(13). 치료 적, IFN이 다발성 경화증 (14)을 치료하는 데 사용되며, 이러한 털 세포 백혈병 (18)과 만성 골수성 백혈병 (19) 등의 HBV (15)와 HCV 16, 17, 및 암과 같은 만성 바이러스 성 감염. 특정 생리 학적 과정에서 IFN의 관련성에 대한 질문은 지속적으로이 사이토 카인 가족의 유비쿼터스 특성을 알 수있다.
특히 IFN-α 아형, 종종 하나의 엔티티 20-23로보다는 밀접하게 관련 그룹,하지만 서로 다른 단백질로 간주됩니다 I IFN을 입력합니다. 척추 동물의 진화 (24)에 걸쳐 존재와 IFN-α 서브 타입을 포함하여 여러 IFN 종의 지속성, 이러한 서브 타입의 적어도 일부는 특정 또는 고유 기능을 가지고 있음을 시사한다. 이는 IFN 발현의 패턴 형성 및 해독 아형 (17)의 하나 이상의 특정 기능을 특성화하는 것이 도움이 될 수있다. t 공부의 도전그는 자신의 공유 시퀀스 정체성을 기반으로 I과 III IFN 하위 유형을 입력 : 열두 IFN-α 아형이> 50 % (25)을 공유하고 IFN-λ 아형 자신의 아미노산 서열의 81~96% (26)를 공유 할 수 있습니다. 설명 QRT-PCR 분석에서, 분자 표지 (MB) 및 잠금 핵산 (LNA) 형광 프로브는 매우 유사한 IFN 하위 유형 시퀀스 사이의 단일 염기 쌍의 차이를 구별하고, IFN 식 서명의 특성을 허용. 분석의 384 웰 플레이트 형식은 각각 성적 증명서 사본 번호와 ΔCq에 의한 분석을 가능하게 정량 (전사 기준) 및 반 정량적 (하우스 키핑 유전자 (HKG)) 조치가 모두 포함됩니다. 프라이머 / 프로브 (PR / 납)를 통해 건조 가능한 자동화 된 멀티 채널 피펫 팅하고, 장기 보존에 의해 용이하게 배치 조립체는, 분석의 재현성, 유틸리티, 실용성을 강화 플레이트 상에 설정한다.
이 프로토콜은 프로세스를 설명합니다384 잘 QRT-PCR 분석 플레이트 인간 IFN 서브 타입 (표 1)을 대상으로 최대 17 개국 PR / 납 세트와 (그림 1)의 제조. PR / Pb와 콘텐츠 소스 플레이트 (도 2) 로봇 멀티 채널 피펫을 사용하여 자동화 될 수있는 프로세스에서 여러 분석 384- 웰 플레이트를 제조하기 위해 사용되는 작업 세트. 초기 포커스 인간 IFN 식 서명을 연구하기위한 프로토콜을 만드는 동안,이 방법은 물론 붉은 털 원숭이에 적용되어왔다. 플레이트 레이아웃이 다소 상이하고, PR / 납 세트 (표 2)는 별개이지만, 인간의 붉은 털 플레이트를 만들기위한 전반적인 제조 방법은 동일하다. 프로토콜의 최소의 변경으로, 상기 방법은 밀접하게 관련된 유전자의 다른 그룹을 연구하는 분석법의 개발을 허용하기 위해 수행 될 수있다.
참조 그림 1과 아래 2
표 1 및 표 2를 참조 벨오우
Protocol
Representative Results
Discussion
이 보고서는 설계, 배치 생산 및 연구 실험실 설정에서 매우 유사한 유전자의 집합의 전사를 측정하기위한 분석의 분석을 향해 접근 방법을 설명합니다. 여기에보고 높은 처리량 QRT-PCR 분석은 IFN-γ 및 측정 – 높은 특이 λ 하위 유형. 이 방법은 두 가지 주요 측면, 상동 유전자 가족의 구성원 및 홍보 / PB 세트가 미리로드 안정적이고 일관성있는 384 웰 분석 판의 제작을위한 생산 플랫폼의 개발을 구별 PR / 납 세트의 디자인을 포함한다. QRT-PCR 프로브는 자신의 특이성 (29)을 강화쪽으로 구조 (MB) 또는 화학 물질 (LNA) 접근 방식을 통합합니다. 서스 분석 (표 2)의 프라이머 세트의 두 들어, 증폭 불응 돌연변이 시스템 (ARMS)은 상기 특이성을 향상 30 프라이머 서열 내로 통합되었다. 그것은 enha에 엑손 – 엑손 접합을 대상으로 가장 좋습니다 동안유형 I 유전자는 인트론이 부족 IFN 때문에 QRT-PCR 반응의 후부 특이성이 가능하였습니다. 따라서, 게놈 DNA를 PCR 반응에서 증폭 할 것이고, 이후에 RNA 추출의 DNase 처리에 의해 분해되어야한다.
PR / 납 세트의 타깃 영역은 각각의 IFN에 대한 성숙 펩티드의 코딩 영역으로 제한되었다. 때문에 IFN-α 아형, 특히 성숙 펩타이드 지역 중 높은 서열의 유사성, 그것은 특이성을 확인하기 위해 감도를 손상 때때로 필요했다. 특히 다른 IFN-α 서브 타입에 비해 성숙한 펩타이드 성적은 네 개의 고유 한 염기가 IFN-α17와 사건이었다. 대상 IFN-α17 프로브 특이성을 제한하는 여러 아형의 성적 증명서를 결합하는 프라이머를 요구했다. 그 결과, PCR 반응시켜 PCR 시약 및 loweri의 상당한 부분을 차지하는만큼, IFN-α17 이외 아형을 증폭 할IFN-α17 대한 특이 적 프로브의 형광 신호의 진폭 겨. 이러한 IFN으로 매우 유사한 유전자 민감하고 특정 PR / 납 세트를 디자인으로 추가 과제는의 GenBank 데이터베이스에 주석 시퀀스는 디자인시 전체 또는 명시되지 않은 다른 항목이있을 수도 있다는 가능성이다. 다시이 새로 주석 서열 완벽 설계시에 데이터베이스의 시퀀스의 버전과 정렬되지 않은에서 IFN-α17위한 도전이었다. 잠을 설계 할 때 따라서 / (PB)은 예의 검토되지 않은 유전자 세트, 주기적으로 표적 유전자의 최신 주석 서열을 확인하는 것이 현명하다. 마지막으로, PR / 납 셋이 전사되지만 번역되지 될 수 가유를 증폭하지 않도록 할 필요가있다.
PR / 납 세트를 설계 한 후, 다음 과제는 17 개국 홍보 / PB의 PCR 조건을 최적화하는 것은 하나의 384 웰 플레이트에 설정합니다. 성적 표준 impor의 아르홍보 / PB 세트의 특이성을 테스트하고 수많은 다른 PCR 반응의 QRT-PCR 조건의 조화를 위해 필수적이 될에 TANT. 성적 기준에 대해 홍보 / PB 세트를 테스트하는 것은 효율성과 감도를 설정; 매우 유사한 발현 유전자를 발현하는 플라스미드 설정 PR / 납 선택적 기능 유전자의 전사를 측정하는 것을 보장 할 필요가있다. 전 사체 수준은 하우스 키핑 유전자 (ΔCq) 내지 반 정량 분석 상대적인 이외에 정량적 분석 수단 (전 사체의 수)를 제공한다.
다중 384- 웰 분석 플레이트로 96 웰 플레이트에서 소스 로봇 멀티 채널 피펫은 정밀도와 플레이트 간 결과의 일관성을 개선한다. 수행이 플레이트에 분주 시약으로 건조 연어 정자 DNA (ssDNA를)를 안정화시키고 장기 기억 PR / 납 세트를 유지 담체로서 사용된다. 플레이트를 건조시켜 또한 반응의 볼륨이 작아결과적으로 귀중한 샘플을 보존하고 비싼 시약의 사용을 감소 재현 가능한 결과, 필요한. 이 단계를 통해, 판의 배치는 6 개월 이상 정밀도와 일관성을 제공하는 조립된다.
판 준비에 따라, 품질 관리 대책은 판의 배치의 일관성을 확인하는 것이 중요하다. 이를 위해, 표준의 추가로 네 세트 접시에 실행됩니다. "5 배 표준"판 성능을 추적하고 개인 판의 표준이 비교되는 데이터 세트를 생성합니다. 각 표준의 열 10 배 희석은 분석 설계시 사용되지만, 공간 고려 네 점은 각각의 분석 플레이트에 표준 곡선에 사용하고, 5 배 표준 플레이트에 대한 것을 요구한다. 또한, 양성 대조군은 플레이트의 무결성을 보장하기 위해 각 플레이트에 포함되어야한다.
일반적으로, 그것은 홍보 / PB의 하나에서 여섯 분석 플레이트를 준비하기 위해 3 ~ 4 시간 소요ource 판; 이 연구 실험실에서 하루에 열두 판을 준비 가능하다. 각 인간 IFN 하위 유형 분석 플레이트 열일곱 PR / 납 세트를 검사하고 다섯 실험 샘플을 수용 할 수 있기 때문에, 어셈블리의 어느 날 3060 실험 데이터 포인트를 생성 할 수있는 능력과 판의 배치를 생산하고 있습니다. QRT-PCR 플랫폼 원시 데이터가 처리 및 자동 분석 미리 디자인 템플릿을 채우기 위해 스프레드 시트 애플리케이션 소프트웨어에서 프로그램 스크립트를 사용하여 조립 될 수있다. 이 방법은 손에 데이터를 입력함으로써 방지 복사 오류를 최소화하고 조사 데이터 분석이 아닌 데이터 어셈블리에 초점을 맞출 수 있습니다. 여기에 설명 된 바와 같이, 높은 처리량이 QRT-PCR 분석은 인간 또는 붉은 털 원숭이 샘플 인터페론 아형의 발현을 측정하는 데 적용 할 수있는 다른 화학 종 또는 상동 유전자 세트를 사용하도록 구성 될 수있다. 플레이트 레이아웃의 유연성은 사용자가 프라이머를 변경할 수 있습니다 / 프로브의 유전자를 맞게 설정특정 세포 유형 또는 모델 시스템을 향한 관심. 이 분석은 면역 반응에 관여하는 신호 전달 메커니즘을 해명 병원체를 연구 세포 배양 모델에서 또는 질병 모델의 컨텍스트의 환자 샘플에서 IFN 식 서명을 측정하기 위해 적용될 수있다.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 CBER / FDA-NIAID / NIH 부처 간 계약 YI-AI-6153-01, FDA / CBER 교내 자금 및 FDA 의료 대책 이니셔티브에 의해 지원되었다. TCT는, MNB는 VPM은, LMS, 그리고 KDK는 미국 에너지 Departmen과 미국 사이의 부처 간 계약을 통해 과학 교육의 오크 리지 연구소에 의해 관리 생물 의약품 평가 연구 센터의 연구 참여 프로그램에 대한 약속에 의해 지원되었다 식품 의약품 안전청.
Materials
| 0.2mL PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
| 12-channel Electronic Pipette, 5-250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
| 2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
| 8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
| Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
| E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
| Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
| Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
| Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
| LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
| LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
| Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
| MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
| Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
| Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
| Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
| Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
| RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
| RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
| Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
| SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
| ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
| Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
| Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
| Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
| Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |
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