Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder
Özet
This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.
Abstract
Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.
Introduction
Typ I und Typ III-Interferone (IFN) sind kritisch bei der Immunantwort auf Viren und anderen pathogenen Stimuli und Zeit in allen Vertebraten 1. Immun- und Nicht-Immun-Zellen zu exprimieren und sezernieren, aber auch reagieren auf, IFN 2. Angeborenen Immunsensoren, wie Toll-like Rezeptoren (TLR), STING und RIG-I, induzieren Typ I und III IFN-Expression bei Erkennung pathogen associated molecular patterns (PAMP) 3,4. Beim Menschen Typ I IFN umfassen IFN-β, -ω, -κ und 12 Subtypen von IFN-α und binden an den IFNAR1 / IFNAR2-Rezeptorkomplex 2,5. Typ III IFN gehören IFN-λ1, -λ2 und -λ3 und auf die IL10RB / IL28RA Rezeptor-Komplex 2 zu binden. Klassisch, Typ I und III IFN binden an ihren jeweiligen Rezeptor-Komplexe, die dann rekrutieren STAT1 / STAT2 Heterodimere und die Transkription der Interferon-stimulierte Gene (ISG) 6. ISG in ein breites Spektrum von Funktionen beteiligt, von antiviralen und antiproliferative Aktivität zur Aktivierung der adaptiven Immunantwort. 7
Die zahlreichen Mechanismen Krankheitserreger entwickelt haben, um zu entgehen, unterlaufen, und die Entführung von Elementen der IFN-Signalweges zeigen die Bedeutung von IFN in der angeborenen Immunantwort 8. Zum Beispiel Vaccinia-Virus exprimiert ein Köder-Rezeptor mit IFNAR1 Homologie, die Typ-I-IFN 9 während ein Yaba-like disease virus sondert ein Glykoprotein, das Typ I und III IFN Proteine hemmt 10 maskiert. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Verteidigung des Wirts werden IFN auch in Krebsüberwachung und einer Reihe von Auto-entzündlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht: Silencing von IFN-Expression in Brustkrebs-Zellen einschränkt immunosurveillance 11 ist eine Überproduktion von IFN-α ein Mechanismus in der Entwicklung von systemischer Lupus erythematodes 12 und fehlerhafte Aktivierung des STING führt zu systemischen Entzündung durch übermäßige Mengen von IFN in STING-assoziierten Vaskulopathie verursacht13. Therapeutisch IFN verwendet werden, um Multiple Sklerose zu behandeln 14, chronischen Virusinfektionen, wie HBV 15 und HCV 16,17 und Krebsarten, wie Haarzellenleukämie 18 und chronischer myeloischer Leukämie 19. Fragen über den Stellenwert von IFN in einem bestimmten physiologischen Prozess zeigen kontinuierlich die allgegenwärtige Natur dieser Zytokin-Familie.
Typ-I-IFN, insbesondere der IFN-α-Subtypen, werden häufig als eine Einheit 20-23, anstatt als eine Gruppe von eng verwandten, aber verschiedene Proteine betrachtet. Die Existenz und die Persistenz von mehreren IFN-Spezies einschließlich der IFN-α-Subtypen, ganz der Wirbeltierevolution 24 wird vorgeschlagen, dass zumindest eine Teilmenge dieser Subtypen spezifische oder spezielle Funktionen. Es ist möglich, dass die Festlegung Muster IFN Ausdruck wird zu entschlüsseln und zur Charakterisierung der spezifischen Funktionen von einem oder mehreren der Subtypen 17. Die Herausforderung des Studiums ter I und III IFN Subtypen geben auf ihrer gemeinsamen Sequenzidentität zu Grunde: die zwölf IFN-α-Subtypen teilen> 50% 25 und die IFN-λ-Subtypen Aktien 81-96% 26 ihrer Aminosäuresequenzen. In der beschriebenen qRT-PCR-Assay, Molecular Beacons (MB) und die Locked Nucleic Acid (LNA) Fluoreszenzsonden unterscheiden einzigen Basenpaar Unterschiede zwischen den in hohem Maße ähnlich IFN-Subtyp-Sequenzen und ermöglichen die Charakterisierung der IFN-Expression Signatur. 384-Well-Plattenformat des Assays umfasst sowohl quantitative (transcript-Standards) und semi-quantitative (die Haushaltsgene (HKG)) Maßnahmen, was eine Analyse durch Transkript Kopienzahl und ΔCq auf. Batch Montage, durch automatisierte Mehrkanalpipetten, und die Langzeitlagerung, möglich durch das Trocknen der Primer / Probe (Pr / Pb) erleichtert setzt auf den Platten, erhöhen die Reproduzierbarkeit, Nutzen und Praxistauglichkeit des Assays.
Dieses Protokoll beschreibt den Prozesszur Herstellung von 384-Well-qRT-PCR-Platten (1) mit bis zu siebzehn verschiedenen Pr / Pb Sätze Targeting human IFN-Subtypen (Tabelle 1). Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager Quelle Platten (Bild 2) werden verwendet, um mehrere 384-Well-Assayplatten in einem Prozess, der mit Hilfe eines Roboter-Mehrkanalpipette automatisiert werden kann vorzubereiten. Während die anfängliche Schwerpunkt lag auf der Erstellung eines Protokolls für das Studium der menschlichen IFN-Expression Signaturen hat sich diese Methode, um Rhesusaffen als auch angewendet. Obwohl die Plattenlayouts sind etwas anders und die Pr / Pb Sätze (Tabelle 2) unterscheiden, ist die Gesamtherstellungsverfahren für die Erstellung der menschlichen und Rhesus-Platten identisch. Mit minimalen Modifikationen des Protokolls kann das Verfahren ausgeführt werden, um für die Entwicklung von Assays für andere Gruppen von eng verwandten Genen zu untersuchen erlaubt.
Siehe 1 und 2 unten
Siehe Tabellen 1 und 2 Below
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Bericht beschreibt Design, Chargenproduktion, und einen Ansatz zur Analyse eines Assays, um die Transkription einer Reihe von sehr ähnlichen Genen in einer Forschungslaborumgebung zu messen. Die Hochdurchsatz-qRT-PCR Assay die hier berichtet misst die IFN- und – λ-Subtypen mit hoher Spezifität. Bei diesem Verfahren werden zwei wichtige Aspekte, die Gestaltung von Pr / Pb-Sets, die zwischen den Mitgliedern einer homologen Genfamilie und der Entwicklung einer Produktionsplattform für die Erstellung von zuverlässigen und konsistenten 384er Testplatten mit den Pr / Pb-Sets vorinstalliert diskriminieren. Die qRT-PCR-Sonden enthalten einen strukturellen (MB) oder chemische (LNA) Ansatz zur Verbesserung ihrer Spezifität 29. Für zwei der Primersätze in Rhesus Assay (Tabelle 2) wurde die Amplifikation Refractory Mutation System (ARMS) in die Primersequenzen enthalten, um die Spezifität weiter zu verbessern 30. Zwar ist es in der Regel am besten, Exon-Exon-Verbindungen zu ENHA Zielnz Spezifität eines qRT-PCR-Reaktion war das nicht möglich, weil der Typ I IFN-Gene fehlen Introns. Daher wird genomische DNA in die PCR-Reaktion amplifiziert werden, und müssen von einer DNase-Behandlung nach der RNA-Extraktion beeinträchtigt werden.
Die Zielregion für die Pr / Pb Sets wurde zu den codierenden Regionen der reifen Peptids für jede IFN beschränkt. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit zwischen den IFN-α-Subtypen, insbesondere der reifen Peptidregion, war es manchmal erforderlich, um die Empfindlichkeit zu beeinträchtigen, um die Spezifität sicherzustellen. Dies war insbesondere der Fall bei IFN-α17, wo das reife Peptid Transkript hat nur vier einzigartigen Basen, wenn gegen die anderen IFN-α-Subtypen verglichen. Targeting IFN-α17 erforderlich Primern, die Transkripte mehrerer Subtypen binden, Einschränkung Spezifität der Sonde. Als Folge davon wird die PCR-Reaktion anderen Subtypen als IFN-α17 verstärken, wodurch ein wesentlicher Prozentsatz der PCR-Reagenzien und loweri aufwendigng die Amplitude des Fluoreszenzsignals aus der spezifischen Sonde für IFN-α17. Eine zusätzliche Herausforderung zur Gestaltung von sensitiven und spezifischen Pr / Pb-Sets für sehr ähnliche Gene wie dem IFN ist die Möglichkeit, dass die annotierte Sequenzen in der GenBank-Datenbank möglicherweise nicht vollständig oder Informationen zum Zeitpunkt der Konstruktion. Auch dies war eine Herausforderung für die IFN-α17, in denen neu kommentierte Sequenzen nicht perfekt mit der Version der Sequenz in der Datenbank zum Zeitpunkt der Konstruktion anzupassen. Daher bei der Gestaltung Pr / Pb-Sets für Gene, die nicht intensiv untersucht haben, ist es ratsam, regelmäßig die neuesten kommentierte Sequenz eines Zielgens. Schließlich ist es notwendig, sicherzustellen, dass die Pr / Pb Sätze nicht Pseudogene, die transkribiert werden kann, aber nicht umge amplifizieren.
Nach der Entwicklung der Pr / Pb-Sets, ist die nächste Herausforderung Optimierung der PCR-Bedingungen von siebzehn verschiedenen Pr / Pb oder setzt auf einer 384-Well-Platte. Transcript Standards sind wich-tant bei der Prüfung der Spezifität eines Pr / Pb-Set und eine wesentliche Rolle bei der Harmonisierung der qRT-PCR-Bedingungen der zahlreichen verschiedenen PCR-Reaktionen. Testen eines Pr / Pb-Set gegen die Niederschrift Standards stellt seine Effizienz und Empfindlichkeit; Plasmide, die sehr ähnliche Pseudo ausdrücken kann notwendig sein, um sicherzustellen, dass die Pr / Pb gesetzt misst selektiv die Transkription des funktionalen Gens. Die Niederschrift Standards bieten auch ein quantitatives Mittel der Analyse (Zahl der Transkripte), zusätzlich zu den semi-quantitative Analyse relativ zu einem Housekeeping-Gen (ΔCq).
Roboterkanalpipetten aus einer 96-well Quellenplatte in mehrfache 384-well-Assayplatten verbessert die Genauigkeit und Konsistenz der Plattenzwischenergebnisse. Lachssperma-DNA (ssDNA) als Träger, die stabilisiert und bewahrt die Pr / Pb-Sets für die Langzeitlagerung verwendet, ebenso wie das Trocknen der Reagenzien in den Platten entfallen. Trocknen der Platten verringert auch das Volumen des Reaktionserforderlich für reproduzierbare Ergebnisse, was wiederum bewahrt wertvollen Proben und verringert die Verwendung von teuren Reagenzien. Durch diese Schritte werden Chargen von Platten montiert, die Präzision und Konsistenz für mehr als sechs Monate ist.
Nach Plattenherstellung, sind Maßnahmen zur Qualitätskontrolle entscheidend für die Konsistenz einer Charge von Platten zu überprüfen. Zu diesem Zweck sind vier zusätzliche Sätze von Standards auf einer Platte laufen. Die "5-fach Standard" Platte verfolgt Leistung und erzeugt eine Datenmenge, auf die Standards eines Individuums Schild verglichen. Während zehn 10-fache Verdünnungen jeder Standard in Assay-Design verwendet werden, erfordern Platzgründen, dass vier Punkte für die Standardkurve auf jeder Testplatte für die 5-fach Standard-Platte verwendet, und. Zusätzlich sollte eine positive Kontrolle auf jeder Platte enthalten sein, um die Gültigkeit der Platte zu gewährleisten.
In der Regel dauert es 3-4 Stunden bis sechs Testplatten von einer Pr / Pb s vorbereitenource Platte; es ist möglich, zwölf Platten an einem einzigen Tag in einem Forschungslabor vorzubereiten. Da jeder humanen IFN-Subtyp Assayplatte untersucht siebzehn Pr / Pb-Sets und kann fünfzehn experimentellen Proben unterzubringen, ein Tag der Montage entsteht ein Stapel von Platten mit einer Kapazität bis zu 3.060 experimentellen Datenpunkte generieren. Rohdaten aus der qRT-PCR-Plattform bearbeitet werden können und mit der Programmierung Skripte in einem Tabellenkalkulationsprogramm-Software, um eine vordefinierte Analysevorlage automatisch füllen montiert. Diese Methode minimiert praktische Dateneingabe, wodurch verhindert wird, Kopierfehler und erlaubt es dem Forscher, auf die Datenanalyse, anstatt Daten Montage konzentrieren. Wie hier beschrieben, kann diese Hochdurch qRT-PCR-Assay verwendet, um die Expression von Interferon-Subtypen in der Human- oder Rhesusaffe Proben zu messen und könnte angepasst werden, dass andere Arten oder homologe Gene-Sets verwendet werden. Die Flexibilität des Plattenlayout kann der Benutzer ändern Primer / Sonde setzt, um die Gene von SchneiderInteresse zu einem bestimmten Zelltyp oder Modellsystem. Dieser Assay kann verwendet werden, um IFN-Expression Signaturen in Zellkulturmodellen studiert Pathogenen oder in Patientenproben im Rahmen des Erkrankungsmodellen gemessen, um die Signalmechanismen, die an der Immunantwort beteiligt aufzuklären.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency Vereinbarung YI-AI-6153-01, FDA / CBER intra-Fonds und der FDA Medical Gegen Initiative unterstützt. TCT, MNB, VPM, LMS und KDK wurden von einer Berufung in die Forschung Beteiligungsprogramm in der Mitte für Biologics Evaluation und Forschung durch den Oak Ridge Institut für Pädagogik der Naturwissenschaften durch eine Interagency Abkommen zwischen den USA Departmen für Energie und den USA verwaltet unterstützt Food and Drug Administration.
Materials
| 0.2mL PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
| 12-channel Electronic Pipette, 5-250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
| 2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
| 8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
| Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
| E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
| Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
| Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
| Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
| LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
| LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
| Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
| MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
| Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
| Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
| Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
| Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
| RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
| RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
| Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
| SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
| ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
| Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
| Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
| Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
| Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |
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