강력한, 소규모 HELA 핵 추출물의 준비를위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 이러한 약물이나 RNAi로 치료 세포와 같은 세포의 작은 인구의 사용을 요구 assays를위한 가치있는 것입니다. 방법은 유전자 발현 assays 및 환자 세포 등 다른 세포 유형의 다양한 적용해야합니다.
이해 유전자 발현의 진행의 큰 거래는 체외 시스템에 사용하였습니다. 대부분의 연구 내용은 기능적인 assays는 정지 재배 세포의 10-50 이상 리터에서 대량으로 준비하고 있습니다 추출물을 사용하여 수행됩니다. 그러나 이러한 대규모 준비는 체외 효과에 신속하게 테스트하는 의무가없는 그 생체내 세포 치료법이나 조건에서 다양한 따른 모든 책임은 사용자에게 있습니다. 이 저널 비디오 기사는 예로 HELA 세포를 이용하여 기능성 소규모 핵 추출물 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 자기편 monolayers로 성장 세포와 같은 몇 가지 150 셋처럼 mm 접시를 사용하여 수행됩니다. 소규모 추출물의 효율성을 설명하기 위해, 우리는 그들이 결합 RNA 중합 효소 II의 전사 / 접합 반응에 대한 대량 핵 추출물만큼 활성임을 보여줍니다. 추출물 프로토콜의 유틸리티를 입증하기 위해, 우리는 접합이 HELA 세포에서 준비 추출물에 폐지되는 표시S는 접합 억제제 약물 E7107로 치료. 소규모 프로토콜은 세포 추출물을 사용하여 체외에서 조사받을 수있는 절차 또는 세포 유형에 일반적으로 적용할 수 있어야합니다. 이들은 작은 세포 집단의 사용을 요구 약물, DNA를 손상 대리인, RNAi, 또는 transfection 등 다수의 대리인에 노출 한정된 수량이나 세포에서만 사용할 수있는 환자의 세포를 포함합니다. 또한, 갓 자란 세포의 소량이 편리 및 / 또는 일부 응용 프로그램이 필요합니다.
우리는 monolayers으로 성장 HELA 전지의 소량의 핵 추출물의 준비를 위해 신속하고 재현성 방법을 확립했습니다. 우리는이 추출물은 RNAP II의 전사 / 접합 assays의 동력학과 효율성은 소규모 및 대량 핵 추출물에서 유사한 것을 보여주는 것만으로도 강력한는 것을 보여주었다. 우리는 접합 억제제 약물로 치료 세포에서 준비 추출물이 전사하지만, 접합의 결함에 대해 활성 중입니다 그 입증하여 추출물의 유틸리티를 보여주었다.
소규모 핵 추출물 준비를위한 우리의 방법은 이전에 대규모 1,8의 정지 재배 HELA 세포의 추출물과 추출물 9 소규모 준비를위한 방법을 만들기 위해 정해진 방법을 결합 및 최적화에 의해 설립되었습니다. 이전의 소규모 추출물 등 결합 녹음 / SP로, 일부 assays를위한 기능성하지 않았기 때문에 우리는 우리의 프로토콜을 설립분석을 licing. 이전의 소규모 프로토콜 9과 우리 사이의 중요한 차이점은 이전 프로토콜이 작은 게이지 바늘 9까지 그들을 추진하여 세포를 lysed 반면, 우리가 미니 dounce을 사용하여 세포를 lysing위한 조건을 최적화한다는 것입니다. 추출물 일부 assays에 대한 재현해 비활성 및 / 또는 어려웠다 이유를 설명 수도 거품의 바늘 용해 결과. 우리는 또한 우리의 프로토콜에 농도 단계를 추가했다. 이 단계는 농도에 매우 민감 추출물의 활동을 증가 시키며, 또한 소규모 준비에 내재된입니다 추출물 간의 다양성을 제한합니다. 마지막으로, 우리의 준비는 일상적으로 대량 추출에 비해 활동에 어떤 큰 영향없이 단일층 전지의 세 개만 150mm 접시로 수행됩니다. 따라서, 프로 시저는 값비싼 시약 또는 제한된 셀 가용성을 필요로 소규모 준비를위한 즉시 의무가있다. 예를 들어, 우리는 SMA를 준비했습니다됩니다 규모 RNAi의 최저 세포에서와 만성 림프 백혈병 (CLL) 환자 세포에서 추출물,하고 기능 및 / 또는 생화 학적 assays (EGF, JLH, 타이와 RR, 게시되지 않은)에 대해 이러한 추출물를 사용했습니다. 우리는 RNAi와 같은 immunopreciptations, 서부 영화, 그리고 실버 염색법과 같은 특정 생화 학적 assays, 그 다음에 대한 추출물은 가치있는 것으로 나타났습니다. 특정 단백질을 노크의 효능을 맺은 후, 더 자세한 연구는 저렴한 비용으로 추가 추출물을 준비하는 데 사용할 수있는 안정적인 최저의 세포 라인을 만들어 실시 할 수 있습니다. 단백질의 질량 분광법은 또한 메서드의 유용한 어플 리케이션이 될 것입니다 이러한 최저의 세포 라인에서 얻은 immunoprecipitates로 제시. 우리 마을은 우리가 프로토콜에 대한 예제로 사용되는 결합 전사 / 접합 분석 이외에 소규모 추출물은 다른 일에 사용되는 것처럼 다양한 기능 및 생화 학적 assays에 일반적으로 적용되어야유전자 발현의 EPS (상한, 접합, 전사, polyadenylation, microRNA 처리 예). 프로토콜도 어느 서스펜션에서 얻어진 (예 : CLL 세포) 또는 (예 : 환자의 섬유아 세포 등) 문화로 성장하실 수 있습니다 환자의 세포 유형에 적응하실 수 있습니다. 마지막으로, 절차를 수행하는 동안 얻은 세포질 분획은 세포질이 필요한 기능과 생화학 두 assays에 대한 유용합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 M. Winkelbauer – 상처, E. 이브라힘, P. 발렌시아, K. Dufu, 유용한 토론을위한 H. 쳉에게 감사합니다. HELA 세포는 국립 셀 문화 센터 (미네 아 폴리스, 미네소타)에서 얻은되었다. 우리는 또한 가벼운 현미경으로 도움을 하버드 의대에서 E7107과 니콘 이미징 센터를 제공하는 Eisai 주식 회사 감사합니다. 이 작품은 JLH하는 RR과 EGF와 NRSA 사귐에 NIH 교부금 GM043375에 의해 지원되었다.
Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
150mm Plates | VWR | 353025 | |
Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
Solution | Final | Stock | Dispense |
Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water | |||
Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.