Ein Protokoll für die Vorbereitung der robuste, kleine HeLa Kernextrakten beschrieben wird. Dieses Protokoll ist wertvoll für Tests, die Verwendung von kleinen Populationen von Zellen, wie Zellen mit Medikamenten oder RNAi behandelt erfordern. Verfahren sollte für eine Vielzahl von Genexpressions und anderen Zelltypen, einschließlich Zellen des Patienten.
Ein großer Teil der Fortschritte im Verständnis der Genexpression wurde unter Verwendung von in vitro Systemen. Für die meisten Studien werden funktionelle Assays unter Verwendung von Extrakten, die in loser Schüttung von 10 bis 50 oder mehr Liter Zellen in Suspension gewachsen sind bereit, durchgeführt. Jedoch sind diese in größerem Maßstab durchgeführt nicht zugänglich schnell Test in vitro Wirkungen, die aus einer Vielzahl von in vivo zellulären Behandlungen oder Bedingungen. Die Zeitschrift Video Artikel zeigt ein Verfahren zur Herstellung funktioneller kleinen nukleären Extrakten mit HeLa-Zellen als ein Beispiel. Dieses Verfahren wird unter Verwendung von nur drei 150 mm-Platten von Zellen als adhärente Monoschichten gewachsenen durchgeführt. Um die Effizienz der Klein-Extrakten zu veranschaulichen, zeigen wir, dass sie so aktiv wie lose gekoppelte Kernextrakten für RNA Polymerase II Transkription / Spleißen Reaktionen sind. Um das Dienstprogramm des Extraktes Protokoll zu demonstrieren, zeigen wir, dass Spleißen in Extrakten aus HeLa-Zelle vorbereitet wird abgeschaffts behandelt mit dem Spleißen Hemmer Medikament E7107. Die kleinräumige Protokoll sollte allgemein für jeden Prozess oder Zelltyp, der in vitro untersucht werden können, mit Zellextrakten. Dazu gehören Zellen des Patienten, die nur in begrenzten Mengen oder Zellen, die zahlreiche Mittel, wie Arzneimittel, DNA-schädigende Mittel, RNAi oder Transfektion, die die Verwendung von kleinen Zellpopulationen erfordern. Darüber hinaus sind kleine Mengen frisch gezüchtete Zellen bequem und / oder die für einige Anwendungen.
Wir haben eine schnelle und reproduzierbare Verfahren zur Herstellung von Kernextrakten von kleinen Mengen von HeLa-Zellen als Monolayer gewachsen eingerichtet. Wir haben gezeigt, dass diese Extrakte robust durch die zeigen, dass die Kinetik und Effizienz der RNAP II Transkription / Spleißen Assays ähnlich in den Klein-und Bulk-Kernextrakten sind. Wir zeigten den Nutzen der Extrakte durch den Nachweis, dass Extrakte aus Zellen mit einem Medikament behandelt Inhibitor Spleißen vorbereitet aktiv sind, für die Transkription aber defekt beim Spleißen.
Unsere Methode zur Herstellung kleinen nukleären Extrakten wurde durch Kombinieren und Optimierung von Methoden zur Herstellung zuvor Extrakte aus HeLa-Zellen in Suspension in großem Maßstab gezüchtet 1,8 und ein Verfahren für die kleine Herstellung von Extrakten 9 wurde hergestellt. Wir haben unsere Protokoll, weil die früheren kleinen Extrakte wurden nicht funktionsfähig für einige Assays, wie der gekoppelte Transkription / splicing Assay. Ein wichtiger Unterschied zwischen dem bisherigen kleinräumigen Protokoll 9 und unser ist, dass wir Bedingungen zur Lyse von Zellen mit Hilfe eines Mini-Dounce optimiert, während die vorherige Protokoll lysiert Zellen, indem sie durch eine kleine 9-Gauge-Nadel. Die Nadel-Lyse führt zu Blasen, die erklären, warum die Extrakte inaktiv waren und / oder schwierig, für einige Tests reproduzieren kann. Außerdem haben wir einen Schritt, um unsere Konzentration Protokoll. Dieser Schritt erhöht die Wirksamkeit der Extrakte, die extrem empfindlich auf Konzentration sind, und beschränkt auch die Variabilität zwischen den Extrakten, die naturgemäss zu kleinräumigen Vorbereitungen ist. Schließlich wird unsere Vorbereitung routinemäßig mit nur drei 150 mm Platten von Monolayer-Zellen durchgeführt, ohne nennenswerte Wirkung auf die Aktivität im Vergleich zum Bulk-Extrakten. Somit ist das Verfahren leicht zugänglich für kleinere Präparate, die teure Reagenzien oder begrenzte Zelle Verfügbarkeit erfordern. Zum Beispiel haben wir SMA hergestelltLL-Skala Auszüge aus RNAi-Knockdown-Zellen und von chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) Patienten-Zellen, und verwendet diese Extrakte für die funktionale und / oder biochemischen Assays (EGF, JLH, TY und RR, unveröffentlicht). Wir haben festgestellt, dass die Extrakte sind wertvoll für RNAi gefolgt von spezifischen biochemischen Assays, wie immunopreciptations, Western, und Silberfärbung. Nach der Ermittlung der Wirksamkeit von Zuschlag für ein bestimmtes Protein, kann eine detailliertere Untersuchung durchgeführt, indem eine stabile Knockdown-Zellinie, die als zusätzliche Extrakte bei niedrigeren Kosten herzustellen werden kann durchgeführt werden. Massenspektrometrie von Proteinen, die in Immunpräzipitaten aus diesen Zelllinien erhalten Zuschlag stellt auch eine nützliche Anwendung des Verfahrens sein. Zusätzlich zu der gekoppelten Transkription / Spleißen Assay, dass wir als ein Beispiel für unsere Protokollbeschreibung hier verwendet wird, sollte die kleine Extrakte, die allgemein in zahlreichen funktionellen und biochemischen Assays, wie sie für die verschiedenen Runde verwendeteps in der Genexpression (zB Capping, Spleißen, Transkription, Polyadenylierung, microRNA Verarbeitung). Das Protokoll kann auch für Patienten Zelltypen, die entweder in Suspension erhalten werden können (wie die CLL-Zellen) oder in Kultur gezüchtet werden (z. B. Patienten Fibroblasten) angepasst werden. Schließlich sollte die cytoplasmatische Fraktion während des Verfahrens erhalten, die nützlich für sowohl funktionell als auch biochemische Assays, die in das Zytoplasma erfordern.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, S. Valencia, K. Dufu, H. Cheng für hilfreiche Diskussionen. HeLa-Zellen wurden vom National Zellkultur Center (Minneapolis, MN) erhalten. Wir danken auch Eisai Co., Ltd für die Bereitstellung von E7107 und das Nikon Imaging Center an der Harvard Medical School für die Hilfe bei der Lichtmikroskopie. Diese Arbeit wurde durch ein NIH GM043375 zu RR und EGF und NRSA Gemeinschaft unterstützt werden, um JLH.
Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
150mm Plates | VWR | 353025 | |
Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
Solution | Final | Stock | Dispense |
Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water | |||
Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.