Un protocollo per la preparazione di robusti, piccoli estratti HeLa nucleari viene descritto. Questo protocollo è importante per i saggi che richiedono l'uso di piccole popolazioni di cellule, come cellule trattate con farmaci o RNAi. Il metodo dovrebbe essere applicabile ad un'ampia varietà di analisi di espressione genica e altri tipi cellulari, incluse cellule del paziente.
Una grande quantità di progressi nella comprensione dell'espressione genica è stato realizzato utilizzando sistemi in vitro. Per la maggior parte degli studi, saggi funzionali vengono effettuate utilizzando estratti che sono preparati in massa da 10-50 o più litri di cellule coltivate in sospensione. Tuttavia, queste grandi preparazioni non sono suscettibili di rapido test in vitro effetti derivanti da una varietà di trattamenti cellulari in vivo o condizioni. Questo articolo video di giornale mostra un metodo per preparare funzionali estratti nucleari piccola scala, utilizzando le cellule HeLa come esempio. Questo metodo viene effettuata utilizzando sole tre piastre da 150 mm di cellule cresciute in monostrati aderenti. Per illustrare l'efficienza dei piccoli estratti, si dimostra che essi sono attivi come bulk estratti nucleari per accoppiati RNA polimerasi II trascrizione / splicing reazioni. Per dimostrare l'utilità del protocollo estratto, si dimostra che splicing è abolito in estratti preparati da cellule HeLas trattati con il farmaco inibitore E7107 splicing. La piccola scala protocollo dovrebbe essere generalmente applicabile a qualsiasi processo o tipo di cellula che può essere studiato in vitro con estratti cellulari. Questi includono le cellule dei pazienti che sono disponibili solo in quantità limitate o cellule esposte a numerosi agenti come la droga, gli agenti che danneggiano il DNA, RNAi, o di trasfezione, che richiedono l'uso di popolazioni cellulari di piccole dimensioni. Inoltre, piccole quantità di cellule appena coltivate sono convenienti e / o richiesto per alcune applicazioni.
Abbiamo stabilito un metodo rapido e riproducibile per la preparazione di estratti nucleari di piccole quantità di cellule HeLa come monostrati coltivate. Abbiamo dimostrato che questi estratti sono robusti, mostrando che la cinetica e l'efficienza delle RNAP II trascrizione / saggi di splicing sono simili negli estratti di piccole dimensioni e massa nucleari. Abbiamo mostrato l'utilità degli estratti dimostrando che estratti preparati da cellule trattate con un farmaco inibitore della giunzione sono attivi per la trascrizione ma difettoso in splicing.
Il metodo per preparare estratti nucleari piccola scala è stata stabilita mediante la combinazione e l'ottimizzazione dei metodi precedentemente stabiliti per rendere estratti di cellule HeLa coltivate in sospensione in larga scala 1,8 e un metodo per la piccola preparazione di estratti 9. Abbiamo stabilito il protocollo perché i precedenti piccola scala estratti non erano funzionali per alcuni saggi, come la trascrizione accoppiata / splicing saggio. Una differenza importante tra la precedente piccola scala protocollo 9 e la nostra è che abbiamo ottimizzato le condizioni per la lisi delle cellule utilizzando un mini-Dounce mentre il precedente protocollo lisate le cellule spingendo attraverso un piccolo ago di calibro 9. L'ago-lisi risultati in bolle, che possono spiegare perché gli estratti sono stati inattivi e / o difficili da riprodurre per alcuni saggi. Abbiamo anche aggiunto una fase di concentrazione al nostro protocollo. Questo passaggio aumenta l'attività degli estratti, che sono estremamente sensibili alla concentrazione, e limita anche la variabilità tra estratti che è inerente ai piccoli preparazioni. Infine, la preparazione viene usualmente effettuata con solo tre piastre da 150 mm di cellule monostrato, senza alcun effetto significativo sull'attività rispetto al estratti rinfusa. Pertanto, la procedura è facilmente recuperabili per i piccoli preparazioni che richiedono reagenti costosi o la disponibilità cellulare limitata. Per esempio, abbiamo preparato small scala estratti da cellule atterramento RNAi e da leucemia linfocitica cronica (CLL), le cellule del paziente, questi estratti e utilizzati per le prove funzionali e / o biochimici (EGF, JLH, TY e RR, inedito). Abbiamo scoperto che gli estratti sono preziose per RNAi seguita da specifici saggi biochimici quali immunopreciptations, western e la colorazione d'argento. Dopo aver stabilito l'efficacia di abbattere una proteina particolare, uno studio più dettagliata può essere effettuata facendo un atterramento linea cellulare stabile, che può essere utilizzato per preparare estratti supplementari a costi inferiori. La spettrometria di massa di proteine presenti in immunoprecipitati ottenuti da queste linee cellulari smontabili sarà anche una utile applicazione del metodo. Oltre al accoppiato trascrizione / splicing saggio che abbiamo usato come esempio per la descrizione di protocollo qui, i piccoli estratti dovrebbe essere generalmente applicabile a numerosi saggi funzionali e biochimici, come quelli utilizzati per la st diversieps di espressione genica (es. capping, splicing, trascrizione, poliadenilazione, elaborazione microRNA). Il protocollo può anche essere adattato per tipi di cellule di pazienti che possono essere ottenuti sia in sospensione (come le cellule CLL) o in coltura (quali fibroblasti paziente). Infine, la frazione citoplasmatica ottenuta durante la procedura sia utile per i saggi funzionali e biochimiche che richiedono il citoplasma.
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati a M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valencia, K. Dufu, H. Cheng utili per le discussioni. Cellule HeLa sono stati ottenuti dal National Center cultura cellulare (Minneapolis, MN). Ringraziamo anche Eisai Co., Ltd per la fornitura di E7107 e la Nikon Imaging Center della Harvard Medical School per un aiuto con microscopia ottica. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione al NIH GM043375 RR e FEG e NRSA borsa di studio per JLH.
Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
150mm Plates | VWR | 353025 | |
Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
Solution | Final | Stock | Dispense |
Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water | |||
Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.