يوصف بروتوكول لإعداد قوي وعصائر هيلا الصغيرة النووية. هذا البروتوكول هو قيمة للفحوصات التي تتطلب استخدام المجموعات الصغيرة من الخلايا، مثل الخلايا المعالجة بالأدوية أو رني. ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على طريقة طائفة واسعة من فحوصات الجينات وغيرها من أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا المريض.
وقد أحرز قدر كبير من التقدم في التعبير الجيني في فهم استخدام نظم المختبر. بالنسبة لمعظم الدراسات، وتجرى فحوصات وظيفية خارج باستخدام مقتطفات التي يتم إعدادها في معظم 10-50 أو أكثر لترا من الخلايا التي تزرع في التعليق. ومع ذلك، هذه الاستعدادات واسعة النطاق ليست قابلة للاختبار سريع في المختبر الآثار التي تنجم عن مجموعة متنوعة من العلاجات الخلوية في الجسم الحي أو شروط. هذه المقالة الفيديو مجلة تظهر طريقة لإعداد وظيفي على نطاق صغير مقتطفات النووية، وذلك باستخدام خلايا هيلا كمثال على ذلك. ويتم هذا الأسلوب من استخدام عدد قليل من 3 150 ملم لوحات من الخلايا كما نمت monolayers ملتصقة. لتوضيح كفاءة مقتطفات صغيرة الحجم، وتبين لنا أن تكون نشطة قدر مقتطفات النووي بكميات كبيرة لردود الفعل الديناميكي بوليميريز الحمض النووي الريبي نسخ / الربط الثاني. للتدليل على فائدة من بروتوكول المقتطف، وتبين لنا أن يتم إلغاء الربط في مقتطفات أعدت من خلية هيلاعلاجه مع المخدرات E7107 الربط المانع. وينبغي أن البروتوكول على نطاق صغير تكون قابلة للتطبيق بشكل عام على أي عملية أو نوع من الخلايا التي يمكن أن يتم التحقيق في المختبر باستخدام خلاصات الخلوية. وتشمل هذه الخلايا المريضة التي لا تتوفر إلا بكميات محدودة أو الخلايا المعرضة للعوامل عديدة مثل الأدوية، وكلاء الحمض النووي الضارة، ورني، أو ترنسفكأيشن، والتي تتطلب استخدام السكان زنزانة صغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، كميات صغيرة من الخلايا المزروعة حديثا هي مريحة و / أو المطلوبة لبعض التطبيقات.
قمنا بتأسيس طريقة سريعة وقابلة للتكرار لإعداد مقتطفات النووية من كميات صغيرة من خلايا هيلا كما نمت monolayers. أثبتنا أن هذه المقتطفات هي قوية من خلال إظهار أن حركية وكفاءة فحوصات RNAP النسخ / الربط الثاني تتشابه في مقتطفات النووية الصغيرة الحجم وكبيرة الحجم. وأظهرت لنا فائدة مقتطفات من خلال إظهار أن أعدت مقتطفات من الخلايا تعامل مع الربط المخدرات المانع نشطة للنسخ ولكن عيب في الربط.
أنشئت لدينا وسيلة لإعداد صغار مقتطفات النووية من خلال الجمع بين وتحسين أساليب المحددة سابقا لصنع مقتطفات من خلايا هيلا نمت في التعليق على نطاق واسع في 1،8 وطريقة لصغار إعداد مقتطفات 9. أنشأنا لدينا بروتوكول لأن السابقة على نطاق صغير مقتطفات لم تكن وظيفية لبعض المقايسات، مثل النسخ إلى جانب / ليرة سوريةlicing فحص. فارق مهم بين البروتوكول على نطاق صغير السابقة (9) ولنا هو أننا أمثل الظروف لlysing الخلايا باستخدام dounce صغيرة في حين أن بروتوكول السابقة هي lysed الخلايا من خلال دفعهم من خلال إبرة صغيرة عيار 9. نتائج إبرة تحلل في فقاعات، وهو ما قد يفسر السبب في أن مستخلصات كانت نشطة و / أو صعوبة في إعادة إنتاج لبعض المقايسات. وأضاف نحن أيضا خطوة تركيز على بروتوكول لدينا. هذه الخطوة يزيد من نشاط المقتطفات، والتي هي حساسة للغاية للتركيز، ويحد أيضا من التباين بين المقتطفات التي هي ملازمة لصغار الاستعدادات. أخيرا، ويتم بشكل روتيني إعداد للخروج مع ثلاثة فقط 150 ملم لوحات من الخلايا أحادي الطبقة، من دون أي تأثير كبير على النشاط مقارنة مقتطفات السائبة. وبالتالي، فإن الإجراء غير قابلة بسهولة لصغار الاستعدادات التي تتطلب الكواشف مكلفة أو محدودية توفر الخلية. على سبيل المثال، قمنا بإعداد SMAتستخدم ليرة لبنانية على نطاق مقتطفات من الخلايا ورني ضربة قاضية من خلايا سرطان الدم الليمفاوي المزمن المريض (CLL)، وهذه مقتطفات لفحوصات وظيفية و / أو البيوكيميائية (EGF، JLH، وTY RR، غير منشورة). لقد وجدنا أن لا تقل قيمة عن مقتطفات رني تليها فحوصات البيوكيميائية محددة، مثل immunopreciptations، الغرب، وتلطيخ الفضة. بعد تأسيس فعالية هدمت بروتين معين، ويمكن إجراء دراسة أكثر تفصيلا من خلال جعل ضربة قاضية مستقر خلية الخط، والتي يمكن استخدامها لإعداد مقتطفات إضافية بتكلفة أقل. مطياف الكتلة من البروتينات الموجودة في immunoprecipitates تم الحصول عليها من هذه الخطوط الخلية ضربة قاضية ستكون أيضا مفيدة لتطبيق هذه الطريقة. بالإضافة إلى فحص النسخ / الربط إلى جانب ذلك كنا كمثال لوصف بروتوكول لدينا هنا، ينبغي على مقتطفات صغيرة الحجم قابلة للتطبيق بشكل عام إلى العديد من المقايسات الفنية والكيمياء الحيوية، مثل تلك المستخدمة في الحادي ومختلفالعائد على السهم في التعبير الجيني (مثل وضع حد أقصى، الربط، النسخ، وتجهيز تذييل بعديد الأدينيلات microRNA،). ويمكن أيضا أن البروتوكول يمكن تكييفها لأنواع الخلايا المريضة التي يمكن الحصول عليها إما في تعليق (مثل خلايا CLL) أو تزرع في ثقافة (مثل الخلايا الليفية المريض). أخيرا، يجب على جزء السيتوبلازمية التي تم الحصول عليها أثناء عملية مفيدة لكلا المقايسات الفنية والبيوكيميائية التي تتطلب السيتوبلازم.
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون لإبراهيم إ. م. Winkelbauer-هيرت،، P. فالنسيا، K. Dufu، H. تشنغ لإجراء مناقشات مفيدة. وقد تم الحصول على خلايا هيلا من مركز الخلية الثقافة الوطنية (مينيابوليس، مينيسوتا). كما نشكر ايساي المحدودة لتوفير E7107 ومركز التصوير نيكون في كلية هارفارد الطبية للمساعدة في المجهر الضوئي. وأيد هذا العمل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة GM043375 إلى RR وEGF وزمالة NRSA إلى JLH.
Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
150mm Plates | VWR | 353025 | |
Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
Solution | Final | Stock | Dispense |
Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water | |||
Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.