1. Подготовка катетеры и мышь Антенна для отбора проб доступа (MASA тм) Подготовка артериального катетера, вставив 1,3 см кусок ПЭ-10 (0,011 дюймовый внутренний диаметр) в 6 см кусок силиконовой трубки (0,012 дюйма внутреннего диаметра), как показано на рисунке 1а. Bevel кончик ПЭ-10 со скальпелем таким образом, длина от конца силиконовой до кончика конической составляет 0,9 см. Подготовка венозный катетер, сдвинув 1 мм кусок силиконовой трубки (0,020 дюйма внутреннего диаметра) 1,1 см от конца скошенной 6 см кусок силиконовой трубки (0,012 дюйма внутреннего диаметра), как показано на рисунке 1b. 1 мм кусок силиконовая резина используется в качестве сдерживающих шарик. Для подготовки MASA тм, вставьте каждый из двух 1,3 см куски 25 калибр нержавеющей стали разъемы в каждом из двух 3 см куски ПЭ-20 (0,015 дюйма внутреннего диаметра). Безопасные PE-20/connectors друг к другу, сдвинув 5 мм кусок силиконовая резинатрубки (0.040 дюйма внутреннего диаметра) по области, где стальные трубы и ПЭ-20 с концами. Согните стальных труб на угол ~ 120 ° и отдельные каждую пробирку на ~ 45 °. Место завершена установка в ложку медицинского силиконовый клей, что ПЭ-20 Трубы вертикальные и концы труб из нержавеющей стали выходить за рамки клеем (рис. 1в). Позвольте этому устанавливать в течение 24 часов. 2. Хирургическое катетеризации До хирургии, стерилизации катетеров с 70% этанола, заполните их гепаринизированной физиологическим раствором (200 ЕД гепарина / мл физиологического раствора) и вставки из нержавеющей стали пробки. Анестезию мыши, желательно с использованием метода, который непрерывно обеспечивает анестетика (например, вдыхании ИФ). Использование стерильных, удалить волосы от разреза сайты, использующие кусачки и / или крем для удаления волос и дезинфицировать кожу спиртом затем бетадин скраба. Для установки катетера, удалить волосы наобласти от нижней челюсти к верхней части грудной клетки и между ключиц. Для экстернализации катетеры за голову, удалить волосы в зоне между основанием черепа и межлопаточной области и дезинфицировать кожу спиртом затем бетадин скраба. Положите мышь на спине на потепление поверхности и под просмотр области хирургического микроскопа. Безопасные хвоста и конечностей с хирургической лентой. Безопасные голову в носовом конусе доставки анестезии. Сделайте небольшой вертикальный разрез средней линии 5 мм головной к грудине. Использование щипцы, тупые рассекать ткани, чтобы выставить левую грудино-сосцевидный мускул. Отражение этой мышцы, чтобы разоблачить левой сонной артерии. Аккуратно дразнить от соединительной ткани сердца. Важно в этот момент, чтобы изолировать блуждающего нерва из артерии, не повреждая либо артерии или нерва. Изолировать артерии и перевязывать головного конца с шелковым швом. Свободно узел другогочасть шва на хвостовом конце подвергаются судна. Зажим сосуд с микро-сосудистый зажим зажим на хвостового конца и разрежьте чуть ниже лигируют заканчиваются весной ножницами. Осторожно вставьте катетер насколько зажима. Тщательно выпуска микро-сосудистый зажим зажим и продвижение катетера, чтобы силиконовая резина-PE перехода. Галстук как лигатуры надежно катетер и убедиться, что катетер образцы, подключив свободный конец катетера, чтобы выборка шприц. Сделайте еще один разрез 5 мм справа от средней линии и около 2 мм каудально по отношению к первому разрез. Использование щипцы, тупые рассекать ткани выявить и изолировать право яремную вену. Тщательно лигировать головного конца шелком швом и свободно связать другую часть шва на хвостовом конце. Вырезать чуть ниже головного лигатуры с пружинным ножницами и вставить катетер до сдерживающим шарик. Tie шва за борт и убедиться, что образцы катетер. Тур-н мышь и делают небольшой разрез между лопатками. Туннель 14-иглы под кожу от разреза для артериального катетера, на передней части мыши, в межлопаточной разрез на спине. Тема артериального катетера через иглу экстериоризироваться его в задней части мыши. Повторите эту процедуру для яремную вену катетер по туннельным 14-иглы под кожу на правой стороне мыши из разреза на передней панели для межлопаточной разрез на спине. Зажим артериальный катетер с микро-сосудистый зажим зажим на место разреза между лопатками. Вырезать катетер ~ 1 см выше этого зажима. Место MASA ТМ с нержавеющей стали разъемов, обращенной к главе мыши. Подключите артериального катетера, чтобы нержавеющая сталь разъем указал на левой стороне мыши. Позаботьтесь, чтобы обеспечить Есть никаких отверстий или изломы в катетер. Повторите эти действия для венозного катетера,подключить его к разъему нержавеющей стали, указывающие на правой стороне мыши. Вставьте MASA тм в разрез между лопатками. ПЭ-20 трубки соответствующей яремной вены катетер в том, чтобы в правой части мыши и ПЭ-20 трубки соответствующего артериального катетера должен быть слева. Закрыть брюшной и спинной разрез с нейлоновой нити. Для спинной заключение шов может быть запущен через закаленные силикона MASA тм, чтобы закрепить его на месте. Подтвердить проходимость катетера использованием промывки раствор, содержащий гепарин солевой раствор и антибиотики, чтобы минимизировать риск заражения. Наведите в согреться, чистая клетка для немедленного восстановления. На рисунке 2 показан готовый продукт. Разрешить мыши для восстановления, по крайней мере 5 дней. Монитор веса и общее состояние здоровья. Использование соответствующих послеоперационного обезболивающего режима утвержденной Animal Care учреждения иИспользуйте комитета. 3. Hyperinsulinemic-euglycemic зажим Быстрый мыши для 5-6ч. Для справки, время т = 0 мин относится к концу быстро и начале инсулина и глюкозы в инфузии (то есть зажим период). Установка и график типичного эксперимента представлены на рисунке 3. Использование микро-Renathane или эквивалент трубки для вливания и линии отбора проб. Приостановить двухканальной поворотный выше мыши. Это служит хабом между мышью и инфузионных / выборки шприцы. В ходе эксперимента мышей остается в клетке дома или аналогичный контейнер и привязан к поворотной. Перед подключением мыши, заполнить артериальной линии отбора проб с гепарином физиологического раствора (10 ед гепарина / мл физиологического раствора) и поместите нержавеющая сталь разъем на нижнем конце линии. Оставьте шприц с гепарином физиологическим раствором (очистка шприц), подключенных к верхней части отбора проб. Это будет использоваться для рисования с кровью SAMPле. Заполните линии венозной инфузии с неправительственными организациями, гепаринизированной солевой начиная с вливанием порт поворотный (Сегмент на рисунке 3А) вплоть до нижней линии. Вставьте верхний конец линии и место нержавеющая сталь разъем (или Y-разъем, если болюса должен быть введен) на нижнем конце линии. Если изотопный трассирующими глюкозы (например, [3 – 3 H] глюкозы) в настоящее время переплетаются, безопасный 1 мл шприц, содержащий трассирующими для вливания шприцем. Заполните линии венозной инфузии с трассирующими вместо физиологического раствора (рис. 3В). Три часа в быстро, весит мышь и подключить ПЭ-20 для яремной вены и артериальных катетеров для вливания и линии отбора проб, соответственно. Если управляющая [3 – 3 H] глюкозы трассирующими, начинают грунтовать-непрерывных трассирующими настой при Т = -90 мин (рис. 3С). Типичная доза грунтовка 1 мкКи. Подготовка 0,05 мкКи / мкл [3 – 3 H] глюкозы Solutioя в не-гепаринизированной физиологического раствора. Нагрузка раствора в 1 мл шприц и безопасный шприц в инфузионный насос. Администрирование грунтовки дозы вливая 20 мкл / мин в течение 1 мин. Следуйте с непрерывной инфузии по 0,05 мкКи / мин (1 мкл / мин) для уравновешивания период 90 мин. Подготовка infusates инсулина и глюкозы. Инсулин подготовлен в не-солевой гепаринизированной, содержащий 3% плазмы как носитель (соответствующей концентрации БСА также может быть использован). Глюкоза infusates коммерчески доступны в различных концентрациях (5, 20 и 50%). Подготовка физиологическим раствором мыть erythorocyte инфузата путем получения цельной крови от донора мыши, желательно того же фоне деформации как экспериментальные мыши. Обычно 1 мл цельной крови необходимо на исследование мыши. Центрифуга для разделения крови эритроцитов. Вымойте эритроцитов с 10 Ед / мл гепаринизированной засоленных и центрифуги для отмены физиологического раствора. Определить объем эритроцитов и ресуспендируют в равном объеме 10 Ед / мл heparinized физиологического раствора. Нарисуйте каждый инфузата в 1 мл шприц и безопасной каждый шприц для отдельных насоса вливания. Подключите каждый шприц, чтобы 4-контактный разъем (рис. 3). При т = -15 мин взять образцов крови с медленно составление 50-100 мкл крови на поляну шприц. Зажим артериальный линии отбора проб и удаления очистки шприца. Использование ручного измерения сахара в крови, принимают чтения глюкозы в крови, удалив зажим на артериальной линии отбора проб и позволяя крови течь в полосе метр глюкозы. Как только глюкоза измерение, зажим артериальной линии отбора проб и вставить тупой иглой шприца (выборка шприца) в артериальную линию выборки. Снимите зажим и рисовать объем крови (см. примечание) в выборки шприц. Зажим артериальный линии отбора проб и удаления выборки шприц. Вставьте очистки шприц обратно в артериальной линии отбора проб. Нарисуйте на поршень для удаления пузырьков воздуха и вновь наполнить50-100 мкл крови, который первоначально был составлен. Примечание: объем крови, пробы зависит от того, анализ может быть исполнено. Например, анализ [3 – 3 H] концентрации глюкозы требуется 10 мкл плазмы, так что 50 мкл крови взяты. Это дает 20-30 мкл плазмы, который является достаточным для анализа плюс дополнительные плазмы в случае необходимости. Измерения гормонов и других метаболитов (например, инсулина, свободных жирных кислот), требуют дополнительного отбора проб крови. Внесите крови в шприце выборки в ЭДТА покрытием микропробирок. Центрифуги и собирать плазмы. Хранить плазму на льду до конца учебы или сразу хранить при -20 ° C. Повторите шаги 3,10 через 3,12 при Т = -5 мин. Получить дополнительную крови (50 мкл) для измерения базового уровня инсулина в плазме крови. Мера базовой гематокрита, рисуя кровь в гепарином или ЭДТА обработанных капиллярной трубке. Измерений, полученные птом образцы плазмы при Т = -15 и -5 мин представляют базовые (т.е. поста) значения. После того как образец при Т = -5 мин, заполните линии для инфузии глюкозы, инсулина и физиологическим раствором отмытых эритроцитов до 4-контактный разъем. Подключите 4-контактный разъем для трубки прикреплен к поворотной порт инфузии (или трубка подключена к Y-разъем, если вливая [3 – 3 H] глюкозы), как показано на рисунке 3. Начните вливание солевого-отмытых эритроцитов в первую очередь. Установить скорость инфузии, чтобы заменить общий объем крови быть, отобранная в течение периода исследования (например, если в общей сложности 500 мкл крови, отобранная в течение 120 мин исследования, установить скорость инфузии до 4,2 мкл / мин). В отличие от других infusates, эритроцитов решение имеет красный цвет. Обогащая это решение Первая позволяет для любого потенциального сопротивления или препятствия в инфузии линии, которые будут выявлены и исправлены. Как только эритроцитов достигает инфузата мыши, начнем инсулина иглюкозы вливаний. Это теперь т = 0 мин. Инсулин переплетаются с постоянной, заранее определенной скоростью. Скорость инфузии инсулина из 4 мЕд • кг -1 • мин -1, как правило, подавляет выработку эндогенного глюкозы на 80-100% и стимулировать глюкозы исчезновения в 2-3 раза. Начальная скорость инфузии глюкозы (ГИР) оценивается на основе базового уровня глюкозы в крови и предыдущий опыт. Если вливая [3 – 3 H] глюкозы, можно избрать для увеличения скорости трассирующими вливания, чтобы соответствовать оценкам увеличение глюкозы в обороте (как правило 2-3 раза). Учитывая высокий уровень глюкозы в оборот в мыши, образцы крови должны быть получены от артериальной линии не менее чем через каждые 10 мин для измерения концентрации глюкозы в течение срока эксперимента. Отрегулируйте ГИР для достижения и поддержания целевых euglycemia (рис. 3С). Эта цель может варьироваться в зависимости от модели или цели исследования. Хороший GL целевойucose концентрации 150 мг • л-1, так как это типичная 6ч уровень глюкозы натощак для чау-кормили мышей C57BL/6J. Целью является достижение euglycemia быстро, в идеале в течение первых 40-50 мин, а также иметь глюкозы и ГИР стабильным к началу стационарного периода (Т = 80 мин). Если вливая [3 – 3 H] глюкозы, получить дополнительную кровь при Т = 80, 90, 100, 110 и 120 минут для измерения плазмы [3 – 3 H] глюкозы конкретного вида деятельности. Сбор дополнительной крови при Т = 100 и 120 мин для измерения инсулина в плазме крови и любой другой гормон (ы) или метаболит (ы). При Т = 110 мин, рисовать кровь в гепарином или ЭДТА обработанных капиллярная трубка для измерения зажим гематокрита. После того как образец при Т = 120 мин берется, 2 [14 C] дезоксиглюкозы могут быть введены для измерения тканеспецифические поглощение глюкозы. Администрирование 12 мкКи болюсно в болюсного линии, подключенной к яремной отбора проб (рис. 3В </strong>). Получить образцы крови (50 мкл) от артериальной линии отбора проб на т = 2, 15, 25 и 35 мин после введения болюса для измерения плазмы 2 [14 C] дезоксиглюкозы уровнях. После последнего образца, обезболить мышь с вливанием пентобарбитал дано непосредственно в артериальную линию. Быстро анализировать любые ткани, необходимые для оценки усвоения глюкозы (например, скелетных мышц различного типа, в жировой ткани, сердца, головного мозга) и любые другие ткани (например, печень, селезенка, почки). Привязка замораживания тканей в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° С до анализа. Ткань глюкозы анализируется путем измерения накопления фосфорилированных 2 [14 C] дезоксиглюкозы в замороженных тканях и исчезновение 2 [14 C] дезоксиглюкозы из плазмы. 4. Представитель Результаты Пример результатов, полученных в эксперименте зажим инсулина показано на рисунке 4.Этот пример показывает способность высоким содержанием жиров для осаждения резистентность к инсулину у мышей. Все презентации результатов инсулина зажим должен включать следующие быть интерпретируемым: время хода уровня глюкозы в крови, время хода ГИР и плазменные уровни инсулина (базовый и зажим). Как показано здесь, уровень глюкозы натощак (рис. 4а) и инсулина (рис. 4С) уровни выше у мышей, которых кормили высоким содержанием жиров, что свидетельствует о резистентности к инсулину. Представляя время хода уровня глюкозы всей зажим исследования (рис. 4А) позволяет читателю оценить, насколько хорошо euglycemia был сохранен, что свидетельствует о качестве зажима. Кроме того, время хода ГИР (рисунок 4B) позволяет читателю определить, как быстро стационарных была достигнута. Показаны эти данные, как время курсов значительно более информативным, чем обычной практикой в зажим мыши инсулина литературе представления 2-часовой экспериментв качестве единой точки отсчета представляющие средние значения с неопределенным "зажим" период (4-13). В настоящее время, например, уровни глюкозы были равны между контролем и с высоким содержанием жира кормили групп, но ГИР была значительно ниже в высоким содержанием жиров кормили группы (рис. 4В). Это свидетельствует о обесценения в весь организм инсулина. Зажим уровень инсулина также были выше в высоким содержанием жиров кормили группы (рис. 4С), дальнейшую поддержку присутствия инсулинорезистентны фенотип у этих мышей. Использование изотопного вливаний трассирующими позволяет оценить действия инсулина в определенных тканях. [3 – 3 H] глюкозы используется для оценки скорости эндогенного появление глюкозы (Эндора), который является индекс продукции глюкозы печенью (ПГП) и скорость всего тела глюкозы исчезновения (Rd). В то время как инсулин полностью подавляет HGP у контрольных мышей, это нарушение у мышей кормили высоким содержанием жиров (рис. 4D). Кроме того, способность винсулина, чтобы стимулировать Rd у контрольных мышей скомпрометирована в мышей, которых кормили высоким содержанием жиров (рис. 4E). 2 [14 C] дезоксиглюкозы используется для оценки индекса метаболизма глюкозы (Кв), мера тканеспецифические поглощение глюкозы. Как видно из этого примера, стимулируемое инсулином потребление глюкозы в скелетных мышцах нарушается у мышей кормили высоким содержанием жиров (рис. 4F). Рисунок 1: Подготовка артериальная (А) и (Б) венозных катетеров и (С) MASA тм. Артериальные катетеры готовят путем введения 1,3 см кусок ПЭ-10 около 3 мм в 6 см кусок 0,012 "силиконовой ID. ПЭ-10 наконечник скошенные, что длина от конической к силиконовой составляет 0,9 см. Венозная катетеры, сделанные скользящей небольшой кусочек 0.020 "ID силиконовой 1,1 см от конца скошенной 6 см кусок 0,012" силиконовой ID. 0.020 "ID силиконовой актов кусок как сдерживающее борта к себе лечения катетер яремной вены. Для сборки MASA тм, каждый из двух 1,3 см 25 калибра разъемы вставляется в каждом из двух 3 см куски ПЭ-20. Они удерживаются вместе небольшой кусочек 0,040 "силиконовой ID. Разъемы наклонился, чтобы углом 120 ° и разделенных на угол 45 °. Весь узел погружается в медицинский силиконовый клей. Рисунок 2: катетеризация мыши. Катетеры имплантируется в левую сонную артерию и яремную вену правой. Свободные концы катетеры вовне за голову и связаны с MASA тм. MASA ТМ вводится подкожно между лопатками. Это позволяет для сосудистого доступа в ходе экспериментов инсулина зажим без необходимости сдерживать, ручку или анестезию мыши. JPG "/> Рисунок 3: изображение установки и график эксперимента зажим инсулина. Мышь привязаны к двухканальной поворотный, который действует как концентратор для инфузий и отбора проб шприцы. Типичные установки для экспериментов не используются трассирующие инфузий (А) и с использованием как [3 – 3 H] глюкозы и 2 [14 C] дезоксиглюкозы (В) показано на рисунке. Тайм-линии процедур для создания и выполнения инсулина зажим (C) также показано на рисунке. Во время зажима, образцы крови ( ) Берутся каждые 10 мин для измерения глюкозы в крови. ГИР корректируется для поддержания euglycemia. Образцы для базовой глюкозы в крови, инсулина в плазме крови и плазмы [3 – 3 H] глюкозы принимаются на т = -15 и -5 мин. Образцы для зажима плазмы [3 – 3 H] глюкозы принимаются при Т = 80, 90, 100, 110 и 120 и для зажима инсулина при Т = 100 и 120 мин. 2 [14 C] дезоксиглюкозы назначается после образца при Т = 120 мин и бlood собирается на т = 2, 15, 25 и 35 мин после. Ткани принято после того, т = 35 мин образца. Рисунок 4: Результаты эксперимента инсулина зажим сравнивая мышей на контрольную диету (Chow) мышам с высоким содержанием жиров (HFD). Время хода артериальной глюкозы (А) и ВМР (B), базовый и зажим инсулина (С), Эндора (D), и Rd (E) и скелетные мышцы (икроножные и vastus латеральной) RG (F) показаны. Все результаты свидетельствуют о влиянии кормления с высоким содержанием жира, чтобы вызвать резистентность к инсулину.