1. הכנת צנתרים אנטנה עכבר עבור Access דגימה (מסע tm) הכן קטטר עורקי ידי הוספת חתיכת 1.3 ס"מ PE-10 (0.011 קוטר פנימי אינץ') לתוך חתיכת 6 ס"מ של צינורות silastic (0.012 קוטר פנימי אינץ') כפי שמוצג באיור 1 א. שפוע קצה של PE-10 עם אזמל כך אורך מקצה silastic אל קצה שפוע הוא 0.9 ס"מ. הכן צנתר ורידי ידי הזזה חתיכת 1 מ"מ של צינורות silastic (0.020 קוטר פנימי אינץ') 1.1 ס"מ מהקצה משופעים של פיסת 6 ס"מ של צינורות silastic (0.012 קוטר פנימי אינץ') כפי שמוצג באיור 1 ב. היצירה 1 מ"מ של silastic משמש חרוז הרחקה. כדי להכין tm מסע, להכניס כל אחד משני החלקים 1.3 ס"מ של 25 מחברים מד נירוסטה אל תוך כל אחד משני החלקים 3 ס"מ של PE-20 (0.015 קוטר פנימי אינץ'). אבטח את PE-20/connectors זה לזה על ידי הזזה פיסת 5 מ"מ של silasticצינורות (0.040 קוטר פנימי אינץ') מעל האזור שבו צינורות פלדה PE-20 נפגשים. לכופף את צינורות פלדה לזווית של ° 120 ~ והפרד צינור על ידי ~ 45 °. המקום השלים המתקן בטיפת דבק סיליקון רפואי כזה צינורות PE-20 הוא אנכי ואת הקצוות של צינורות נירוסטה להרחיב מעבר דבק (תרשים 1C). אפשר להגדיר את זה עבור 24 שעות. 2. ניתוח צנתור לפני הניתוח, לעקר צנתרים עם אתנול 70%, למלא אותם עם מלח heparinized (200 הפרין U / ml מלוחים) ולהוסיף תקעים נירוסטה. הרדימי עכבר, רצוי בשיטה ברציפות מספק את סוכן הרדמה (למשל isoflurane בשאיפה). שימוש בטכניקה סטרילית, להסיר שיער מן האתרים חתך באמצעות קוצץ ו / או קרם מקריח ולחטא את העור עם אלכוהול ואחריו לשפשף בבטאדין. עבור החדרת קטטר, להסיר שיער עלהאזור המשתרע מן הלסת התחתונה לחלק העליון של כלוב הצלעות ובין הבריח. עבור החצנה של צנתרים מאחורי הראש, להסיר שיער באזור שבין בסיס הגולגולת לבין אזור interscapular ולחטא את העור עם אלכוהול ואחריו לשפשף בבטאדין. הנח את העכבר על גבו על גבי משטח להתחממות תחת אזור התצוגה של מיקרוסקופ כירורגי. אבטח את הזנב הגפיים בעזרת פלסטר. אבטח את ראש קונוס האף מתן הרדמה. לעשות חתך קטן קו האמצע האנכי 5 מ"מ cephalic אל עצם החזה. בעזרת מלקחיים, בוטה לנתח את הרקמה על מנת לחשוף את השריר sternomastoid שמאל. לשקף את השריר כדי לחשוף את העורק הראשי השמאלי. בעדינות להקניט את רקמת החיבור של העורק. חשוב בשלב זה על מנת לבודד את העצב התועה מן העורק מבלי לפגוע או העורק או העצב. לבודד את העורק ולקשור את הקצה cephalic עם תפר משי. רופף הקשר אחרחתיכת תפר בקצה הזנב של הספינה חשוף. קלאמפ כלי עם מהדק מיקרו serrefine על קצה הזנב וחתכו ממש מתחת בסוף ligated במספריים האביב. בזהירות להכניס קטטר ככל מהדק. בזהירות לשחרר את מהדק מיקרו serrefine ולקדם את הקטטר לצומת silastic-PE. עניבה הן חיבורי אותיות מאובטח הקטטר ולוודא כי דגימות קטטר על ידי חיבור קצה ללא קטטר כדי מזרק הדגימה. תארגנו עוד 5 מ"מ חתך מימין לקו האמצע ו – 2 מ"מ על הזנב עד החתך הראשון. בעזרת מלקחיים, בוטה לנתח את רקמת לחשוף ולבודד את וריד הצוואר הימני. בזהירות ולקשור את הקצה cephalic עם תפר משי רופף לקשור עוד פיסת תפר בקצה הזנב. גזור ממש מתחת המיתר cephalic במספריים האביב להכניס את הקטטר עד חרוז הרחקה. עניבה תפר מאחורי חרוז ולוודא כי דגימות קטטר. ט"וrn את העכבר מעל ולעשות חתך קטן בין השכמות. מנהרת מחט 14-מד מתחת לעור מן החתך של העורקים קטטר, על החלק הקדמי של העכבר, כדי החתך interscapular על הגב. נושא קטטר עורקי דרך המחט אל exteriorize זה בחלק האחורי של העכבר. חזור על פעולה זו עבור קטטר וריד על ידי מנהור את המחט 14-מד מתחת לעור בצד הימני של העכבר מהאתר חתך בחזית אל החתך interscapular על הגב. הצמד את הקטטר עורקי עם מהדק מיקרו serrefine באתר חתך בין השכמות. חותכים את הקטטר ~ 1 ס"מ מעל תפס את זה. מניחים את tm מסע עם מחברי נירוסטה פונה לכיוון ראשו של העכבר. חיבור קטטר עורקי למחבר נירוסטה הצביע לעבר הצד השמאלי של העכבר. תשמרי על עצמך כדי לוודא שאין חורים או סטיות של הקטטר. חזור על הפעולה עבור קטטר ורידי,לחבר אותו למחבר נירוסטה מצביע על הצד הימני של העכבר. הכנס את tm מסע לתוך החתך בין השכמות. צינורות PE-20 המתאים קטטר וריד הצוואר צריך להיות בצד הימני של העכבר ואת צינורות PE-20 המתאים קטטר העורקים צריכה להיות שמאלה. סגור חתכים הגחון ועל הגב עם תפר ניילון. לסגירת הגבי, תפר ניתן להפעיל באמצעות סיליקון מוקשה של tm מסע לאבטח אותו במקומו. אשר patency של צנתרים באמצעות פתרון שטיפה המכילה תמיסת מלח heparinized ו אנטיביוטיקה כדי למזער את הסיכון לזיהום. עכבר המקום בכלוב, חימם נקי להתאוששות מיידית. תרשים 2 מציג את המוצר המוגמר. אפשר בעכבר כדי לשחזר לפחות 5 ימים. צג המשקל ועל הבריאות הכללית. לנצל את הטיפול המתאים לאחר הניתוח כאבים כפי שאושר על ידי טיפול בבעלי חיים של המוסד והשתמש הוועדה. 3. Hyperinsulinemic-euglycemic מהדק מהיר בעכבר עבור 5-6 שעות. כנקודת התייחסות, הזמן t = 0 מתייחס דקות לסיום הצום ותחילת עירוי אינסולין וגלוקוז (נקודה כלומר מהדק). קו הגדרת זמן עבור ניסוי טיפוסי מוצגים באיור 3. השתמש בצינור Micro-Renathane או שווה ערך עבור עירוי קווי הדגימה. להשעות מסתובב ערוץ כפול מעל העכבר. זה משמש כמרכז בין העכבר עירוי / דגימה מזרקים. במהלך הניסוי, העכבר נשאר בכלוב בבית או מיכל דומה, והוא קשור המסתובב. לפני חיבור העכבר, למלא את קו הדגימה עורקי עם מלוחים heparinized (10 הפרין U / ml מלוחים) ומקום מחבר נירוסטה בקצה התחתון של הקו. השאירו מזרק עם סליין heparinized (ניקוי המזרק) מחובר לחלק העליון של קו הדגימה. זה ישמש להכין דם samples. מלאו את עירוי ורידי קו עם מלוחים שאינם heparinized החל הנמל עירוי של המסתובב (קטע ב איור 3A) כל הדרך אל החלק התחתון של הקו. חבר את הקצה העליון של הקו מקום מחבר נירוסטה (או ה-Y, אם מחבר בולוס הוא להיות מנוהל) בקצה התחתון של הקו. אם נותב גלוקוז איזוטופי (למשל [3-3-H] גלוקוז) הוא להיות חדורים, מאובטח מזרק 1 מ"ל המכיל את נותב אל מזרק אינפוזיה. מלאו את עירוי ורידי קו עם נותב במקום מלוחים (איור 3B). שלוש שעות אל תוך הצום, לשקול את העכבר ולחבר את PE-20 עבור עורק הצוואר צנתרים עורקי כדי העירוי קווי הדגימה, בהתאמה. אם מתן [3-3-H] נותב גלוקוז, להתחיל עירוי דרוך רציפה נותב ב t = -90 דקות (איור 3 ג). מנה טיפוסית היא תחול μCi 1. הכן 0.05 μCi / μl [3-3-H] גלוקוז solution ב מליחים שאינם heparinized. טען את הפתרון לתוך מזרק 1 מ"ל ומאובטח את המזרק משאבת אינפוזיה. נהל את המינון תחול על ידי יציקת 20 μl / min דקות 1. עקוב אחר עם עירוי מתמשך של 0.05 μCi / min (1 μl / min) לתקופה איזון 90 דקות. הכן infusates של אינסולין וגלוקוז. אינסולין הוא הכין מליחים שאינם heparinized המכיל פלזמה 3% כנשא (ריכוז מתאים של BSA יכול לשמש גם). Infusates גלוקוז זמינים מסחרית במגוון ריכוזים (% 5, 20 ו – 50). הכן מלוחים שטף infusate erythorocyte על ידי קבלת דם שלם עכבר התורם, רצוי רקע המתח כמו עכבר הניסוי. בדרך כלל 1 מ"ל של דם מלא נחוצה לכל מחקר העכבר. צנטריפוגה לדם אריתרוציטים נפרד. לשטוף עם אריתרוציטים מלוחים U / ml 10 heparinized ו צנטריפוגות כדי למחוק את מלח. קבע את עוצמת הקול של אריתרוציטים ו resuspend בנפח שווה של 10 U / ml heparinized מלוחים. צייר כל infusate לתוך מזרק 1 מ"ל ומאובטח בכל מזרק כדי לשאוב אינפוזיה בודדים. חיבור כל מזרק למחבר 4-way (איור 3). ב t = -15 דקות לקחת דגימת דם על ידי ציור לאט עד 5-10 μl של דם לתוך המזרק ניקוי. הצמד את קו הדגימה עורקים ולהסיר את המזרק ניקוי. באמצעות מד כף יד גלוקוז, לקחת קריאת הגלוקוז בדם על ידי הסרת מהדק על הקו הדגימה בעורקים ומאפשר לדם לזרום לתוך רצועת מד הגלוקוז. לאחר מדידת גלוקוז הוא נלקח, מהדק את הקו הדגימה עורקים להוסיף מזרק בוטה מחט (מזרק הדגימה) לתוך קו הדגימה עורקים. הסר את מהדק וצייר נפח הדם (ראה הערה) לתוך מזרק הדגימה. הצמד את קו הדגימה עורקים ולהסיר את המזרק הדגימה. הכנס את המזרק ניקוי חזרה לתוך קו הדגימה עורקים. צייר על הבוכנה כדי להסיר בועות אוויר מחדש להחדיר את50-100 μl הדם נמשך במקור. הערה: נפח הדם שנדגמו תלוי הניתוח מתבצע. לדוגמה, ניתוח [3-3 ח'] ריכוז הגלוקוז דורש 10 μl של פלסמה, אז 50 μl של דם נמשכים. זה מניב 20-30 μl של פלזמה, וזה מספיק לניתוח פלוס פלזמה נוספים במידת הצורך. מדידות של הורמונים מטבוליטים אחרים (כגון אינסולין, חומצות שומן חופשיות) לדרוש דגימת דם נוספת. לוותר הדם במזרק הדגימה לתוך microtube EDTA מצופה. צנטריפוגה ולאסוף את הפלסמה. שמור את הפלזמה על הקרח עד סוף המחקר או מיד לחנות ב -20 ° C. חזור על שלבים 3.10 עד 3.12 ב -5 דק 't =. להשיג דם נוסף (50 μl) למדידת רמות הבסיס של פלזמה אינסולין. מדד הבסיס המטוקריט ידי זוב דם לתוך צינור נימי הפרין או EDTA שטופלו. המדידות שהתקבלו frאום דגימות פלסמה ב t = -15 ו -5 דקות לייצג את הבסיס (כלומר, צום) ערכים. אחרי המדגם ב -5 דקות = t, למלא את השורות אינפוזיה עבור אריתרוציטים, גלוקוז אינסולין מלוחים שנשטפו למחבר 4-הדרך. חבר את מחבר 4 דרך צינור המחובר ליציאת עירוי המסתובב (או צינור המחובר למחבר ה-Y אם יציקת [3-3-H] גלוקוז) כפי שמוצג באיור 3. בגין יציקת מלוחים שטף אריתרוציטים הראשון. הגדר את קצב העירוי כדי להחליף את הנפח הכולל של הדם להיות שנדגמו על משך הזמן של המחקר (למשל, אם סך של 500 μl של דם נדגמים מעל 120 דק 'של המחקר, להגדיר את קצב העירוי כדי 4.2 μl / min). בניגוד infusates אחרים, הפתרון כדורית אדומה הוא אדום. יציקת זה הפתרון הראשון מאפשר התנגדות או מכשולים פוטנציאליים קווי עירוי להיות מזוהה ותיקן. לאחר infusate כדורית אדומה מגיע העכבר, להתחיל אינסוליןגלוקוז חליטות. זהו עכשיו t = 0 דקות. אינסולין הוא החדיר את שיעור קבוע שנקבע מראש,. עירוי אינסולין בקצב של 4 MU -1 ק"ג • • min -1 יהיו בדרך כלל לדכא ייצור גלוקוז אנדוגני על ידי% 80-100 וממריץ היעלמות גלוקוז על ידי קיפול 2-3. גלוקוז הראשונית קצב עירוי (Gir) מוערך על בסיס רמות הגלוקוז בדם המחקר והניסיון הקודם. אם יציקת [3-3 ח'] גלוקוז, אפשר לבחור להגביר את קצב עירוי נותב כדי להתאים את הגידול מוערך במחזור גלוקוז (בדרך כלל עלייה של פי 2-3). בהתחשב שיעור גבוה של תחלופה הגלוקוז העכבר, דגימות דם יש לקבל קו עורקי לא פחות מ 10 דקות בכל למדידת ריכוז הגלוקוז על משך הניסוי. התאם את Gir כדי להשיג ולשמור euglycemia היעד (איור 3 ג). מטרה זו יכולה להשתנות בהתאם לדגם או המטרות של המחקר. Gl מטרה טובהריכוז ucose הוא 150 מ"ג • ד"ל-1, מאחר שזו רמת גלוקוז בצום 6 שעות טיפוסי עבור עכבר C57Bl/6J האוכל שאוכלים. המטרה היא להשיג euglycemia במהירות, רצוי תוך 40-50 דקות קודם, יש גלוקוז יציבה על ידי Gir בתחילת התקופה היציב (t = 80 דקות). אם יציקת [3-3-H] גלוקוז, להשיג דם נוסף ב t = 80, 90, 100, 110 ו – 120 דקות למדידת פלזמה [3-3-H] פעילות גלוקוז ספציפיים. איסוף דם נוספות בזמן t = 100 ו – 120 דקות למדידה של אינסולין בפלסמה כל הורמון אחר (ים) או מטבוליט (ים). בשלב דקות t = 110, להקיז דם לתוך צינור נימי הפרין או EDTA שטופלו עבור מדידה של מהדק המטוקריט. אחרי המדגם בזמן t = 120 דקות נלקחת, 2 [14 C] deoxyglucose יכול להינתן למדידת ספיגת רקמות ספציפיות גלוקוז. ניהול של 12 בולוס μCi לתוך הקו בולוס מחובר לקו הדגימה הצוואר (איור 3B </strong>). להשיג דגימות דם (50 μl) מקו הדגימה עורקים ב t = 2, 15, 25 ו – 35 דקות לאחר מתן בולוס למדידת פלזמה 2 [14 C] רמות deoxyglucose. אחרי המדגם האחרון, להרדים את העכבר עם עירוי של pentobarbital נתון ישירות לתוך קו עורקי. לנתח במהירות כל הרקמות הנדרש להערכת ספיגת הגלוקוז (שרירי השלד למשל מסוגים שונים, רקמת שומן, לב, מוח) וכל ברקמות אחרות (למשל, הכבד הטחול, הכליות). הצמד רקמות הקפאה בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C עד מנותח. גלוקוז רקמות מנותח על ידי מדידת הצטברות של 2 phosphorylated [14 C] deoxyglucose ברקמות קפואות היעלמותה של 2 deoxyglucose [14 C] מן הפלזמה. 4. נציג תוצאות דוגמה לתוצאות שהתקבלו בניסוי מהדק אינסולין מוצגת באיור 4.דוגמה זו מראה את היכולת של דיאטה שומן גבוהה כדי לזרז התנגדות לאינסולין אצל עכברים. כל המצגות של תוצאות מהדק אינסולין חייב לכלול את הפרטים הבאים להיות לפירוש: קורס זמן של רמות הגלוקוז בדם, קורס הזמן של Gir ואת רמות האינסולין בדם (הבסיס לצבוט). כפי שמוצג כאן, גלוקוז בצום (איור 4 א) ו – אינסולין (איור 4C) רמות גבוהות יותר של עכברים שקיבלו תזונה שומן גבוה, מעיד על עמידות לאינסולין. הצגת קורס זמן של רמות הסוכר לאורך כל תקופת המחקר מהדק (איור 4A) מאפשר לקורא להעריך כמה טוב euglycemia נשמרה, אשר מעיד על האיכות של מהדק. באופן דומה, כמובן זמן של Gir (איור 4B) מאפשר לקורא כדי לקבוע כמה מהר למצב יציב, הושגה. מציג את הנתונים הללו כמו קורסים הזמן הוא משמעותי יותר אינפורמטיבי מאשר בפועל קונבנציונאלי הספרות אינסולין מהדק עכבר הצגת ניסוי 2 שעותכנקודת נתון אחד המייצג את ערכי הממוצע של תקופת "לצבוט" מוגדר (4-13). בדוגמה הנוכחית, רמות הגלוקוז היו שווים בין שליטה גבוהה שומן נמאס קבוצות, אבל Gir היה נמוך משמעותית גבוה שומן נמאס הקבוצה (איור 4B). זה מעיד על ליקוי בפעולה כל הגוף לאינסולין. קלאמפ היו גם רמות אינסולין גבוה גבוה שומן נמאס הקבוצה (איור 4C), נוסף התומך נוכחות של פנוטיפ עמידות לאינסולין אצל עכברים אלה. השימוש חליטות נותב איזוטופי מאפשר הערכה של פעילות האינסולין ברקמות ספציפיות. [3-3-H] הגלוקוז משמש כדי להעריך את שיעור הופעת גלוקוז אנדוגני (endoRa), המהווה מדד הייצור בכבד גלוקוז (HGP) ושער של כל הגוף היעלמות גלוקוז (Rd). בעוד אינסולין מדכאת לחלוטין HGP בעכברים שליטה, זו נפגעת אצל עכברים שקיבלו תזונה שומן גבוה (איור 4D). כמו כן, היכולת של בsulin לעורר Rd בעכברים לשלוט נפגעת אצל עכברים שקיבלו תזונה שומן גבוה (איור 4E). 2 [14 C] deoxyglucose משמש כדי להעריך את חילוף החומרים גלוקוז מדד (RG), מידה של ספיגת רקמות ספציפיות גלוקוז. כפי שניתן לראות בדוגמה זו, אינסולין מגורה ספיגת הגלוקוז לתוך שריר השלד נפגעת אצל עכברים שקיבלו תזונה שומן גבוה (איור 4F). איור 1: הכנת עורקים (A) ו – (ב) צנתרים ורידיים ו (ג) מסע tm. צנתרים העורקים מוכנים ידי החדרת פיסת 1.3 ס"מ PE-10 על 3 מ"מ לתוך חתיכת 6 ס"מ silastic 0.012 מזהה ". קצה PE-10 הוא משופעים כזה באורך שפוע כדי silastic הוא 0.9 ס"מ. ורידי צנתרים מבוצעים על ידי הזזה פיסה קטנה של 0.020 "מזהה 1.1 ס"מ silastic מסוף משופעים של פיסת 6 ס"מ של 0.012" silastic מזהה. .020 "silastic מזהה חתיכת משמש חרוז הרחקה ל se לרפא את קטטר אל הווריד וריד הצוואר. לגבי הרכבה של tm מסע, כל ס"מ 1.3 two-25 מד מחברים מוכנס לתוך כל אחד משני החלקים 3 ס"מ של PE-20. אלה הם מוחזקים ביחד על ידי חתיכה קטנה של silastic 0.040 מזהה ". המחברים כפופות ל 120 ° זווית מופרדים בזווית של ° 45. האסיפה כולו שקוע דבק סיליקון רפואי. איור 2: עכבר צינתור. צנתרים מושתלים בניתוח בעורק התרדמה השמאלי וריד הצוואר הימני. מסתיים ללא צנתרים הם מוחצנים מאחורי הראש ומחובר tm מסע. Tm מסע מוחדר מתחת לעור בין השכמות. זה מאפשר גישה וסקולרית במהלך הניסויים מהדק אינסולין ללא צורך לרסן, לטפל או להרדים את העכבר. jpg "/> איור 3: תיאור ההתקנה של קו הזמן לניסוי מהדק אינסולין. העכבר הוא קשור המסתובב ערוץ כפול שפועל כמרכז עירוי ומזרקים הדגימה. Setups טיפוסית לניסויים לא באמצעות חליטות נותב (א) ו – הן באמצעות [3-3-H] גלוקוז 2 [14 C] deoxyglucose (ב) מוצגים. קו הזמן של הליכים להקמת וביצוע מהדק אינסולין (ג) מוצג גם. במהלך מהדק, דגימות דם ( ) נלקחים כל 10 דקות כדי למדוד את רמת הסוכר בדם. Gir מותאם בהתאם כדי לשמור על euglycemia. דוגמאות של גלוקוז בדם הבסיס, אינסולין פלזמה, פלזמה ו [3-3-H] גלוקוז הם נלקחה ב t = -15 ו -5 דקות. דוגמאות עבור מהדק פלזמה [3-3-H] גלוקוז נלקחים בזמן t = 80, 90, 100, 110 ו – 120 עבור אינסולין מהדק בזמן t = 100 ו – 120 דקות. 2 [14 C] deoxyglucose מנוהל אחרי המדגם בזמן t = 120 דק 'ו – בlood נאסף ב t = 2, 15, 25 ו – 35 דקות אחרי. רקמות נלקחים אחרי המדגם = 35 דק 'לא. איור 4: תוצאות ניסוי אינסולין מהדק השוואת עכברים בדיאטה שליטה (Chow) לעכברים דיאטה שומן גבוהה (HFD). כמובן זמן של גלוקוז עורקי (א) ו Gir (B), הבסיס לצבוט אינסולין (C), EndoRa (ד), ו Rd (E) ואת שרירי השלד (הגסטרוקנמיוס ו vastus lateralis) RG (F) מוצגים. כל התוצאות מצביעות על ההשפעה של האכלה שומן גבוה כדי לגרום תנגודת לאינסולין.