1. Preparação de cateteres e Antena Mouse para acesso de amostragem (MASA tm) Prepare cateter arterial através da inserção de um pedaço de 1,3 centímetros PE-10 (0,011 polegadas de diâmetro interno) em uma peça 6 cm de tubo silastic (0,012 polegadas de diâmetro interno), como mostrado na Figura 1A. Bevel a ponta do PE-10 com um bisturi para o comprimento a partir do final do silastic à ponta do chanfro é de 0,9 cm. Prepare cateter venoso deslizando um pedaço de 1 mm de tubo silastic (0,020 polegadas de diâmetro interno) 1,1 cm da ponta chanfrada de um pedaço 6 cm de tubo silastic (0,012 polegadas de diâmetro interno), como mostrado na Figura 1B. A peça de 1 mm de silastic é usado como um talão de restrição. Para preparar um tm MASA, insira cada um dos dois pedaços 1,3 cm de calibre 25 conectores de aço inoxidável em cada uma das duas 3 peças cm de PE-20 (0,015 polegadas de diâmetro interno). Assegurar a PE-20/connectors uns aos outros por um pedaço de correr 5 mm de silastictubulação (0,040 polegadas de diâmetro interno) sobre a área onde os tubos de aço e PE-20 se encontram. Dobre os tubos de aço a um ângulo de ~ 120 e separar cada tubo by ~ 45 °. Lugar preenchido na plataforma de um montão de adesivo de silicone médica de modo que a PE-20 tubo é vertical e as extremidades dos tubos de aço inoxidável se estendem além do adesivo (Figura 1C). Permitir que isso definido para 24h. 2. Cateterismo cirúrgica Antes da cirurgia, esterilizar cateteres com álcool 70%, preenchê-los com soro fisiológico heparinizado (heparina 200 U / ml de solução salina) e inserir plugues de aço inoxidável. Anestesiar mouse, de preferência usando um método que fornece continuamente o agente anestésico (isoflurano inalado por exemplo). Utilizando uma técnica asséptica, remover os pêlos dos locais incisão usando cortadores e / ou um creme depilatório e desinfectar a pele com álcool seguido por um matagal betadine. Para inserção do cateter, remover os pêlos naregião que se estende desde o maxilar inferior para a parte superior da caixa torácica e entre as clavículas. Para a externalização dos cateteres atrás da cabeça, remover os pêlos na área entre a base do crânio e na região interescapular e desinfectar a pele com álcool seguido por um matagal betadine. Lay o mouse sobre as suas costas em uma superfície de aquecimento e sob a área de visualização de um microscópio cirúrgico. Segura a cauda e extremidades com fita cirúrgica. Segura a cabeça no cone do nariz entregar a anestesia. Faça uma pequena incisão na linha média vertical, 5 milímetros cefálica ao esterno. Utilizando uma pinça, sem corte dissecar o tecido para expor o músculo esternocleidomastóideo esquerdo. Refletir este músculo para expor a artéria carótida esquerda. Gentilmente provocar off tecido conjuntivo da artéria. É importante neste momento para isolar o nervo vago a partir da artéria sem danificar tanto a artéria ou nervo. Isolar a artéria e ligar o final cefálica com fio de seda. Vagamente outro nópedaço de sutura na extremidade caudal do navio exposta. Grampo navio com uma pinça micro-serrefine na extremidade caudal e corte logo abaixo do final ligada com uma tesoura de mola. Insira cuidadosamente cateter até o grampo. Cuidadosamente solte a braçadeira micro-serrefine e avançar o cateter até a junção silastic-PE. Laço tanto ligaduras de forma segura para o cateter e confirmar que as amostras de cateter, ligando a extremidade livre do cateter a uma seringa de amostragem. Fazer outra incisão de 5 mm para a direita da linha média e cerca de 2 mm caudal à primeira incisão. Utilizando uma pinça, sem corte dissecar o tecido para expor e isolar a veia jugular direita. Cuidadosamente ligadura final cefálica com fio de seda e vagamente tie outro pedaço de sutura no final caudal. Corte logo abaixo da ligadura cefálica com tesoura primavera e inserir o cateter até o talão de restrição. Amarrar um fio atrás do talão e confirmar que as amostras do cateter. Turn o mouse sobre e fazer uma pequena incisão entre as omoplatas. Túnel de uma agulha de calibre 14 sob a pele da incisão para o cateter arterial, na parte da frente do mouse, a incisão interescapular nas costas. Passe o cateter arterial através da agulha para exteriorizar-lo na parte de trás do mouse. Repita este procedimento para o cateter da veia jugular por tunelamento a agulha de calibre 14 sob a pele no lado direito do mouse a partir do local da incisão na parte da frente da incisão interescapular nas costas. Prenda o cateter arterial com uma pinça micro-serrefine no local da incisão entre as omoplatas. Corte o cateter ~ 1 cm acima deste grampo. Coloque o tm MASA com os conectores de aço inoxidável de frente para a cabeça do mouse. Conectar o cateter arterial ao conector de aço inoxidável apontado para o lado esquerdo do mouse. Tome cuidado para garantir que não haja furos ou dobras no cateter. Repita o procedimento para o cateter venoso,conectá-lo ao conector de aço inoxidável apontando para o lado direito do mouse. Insira o tm MASA na incisão entre as omoplatas. A tubulação PE-20 correspondente ao cateter da veia jugular deve ser para o lado direito do mouse e do PE-20 tubos correspondentes ao cateter arterial deve ser para a esquerda. Fechar incisões ventral e dorsal, com fio de náilon. Para o fechamento dorsal, a sutura pode ser executado através do silicone endurecido do tm MASA para fixá-lo no lugar. Confirmar a permeabilidade dos cateteres usando uma solução de lavagem contendo salina heparinizada e um antibiótico para minimizar o risco de infecção. Colocar o mouse em uma gaiola, aquecido limpo para recuperação imediata. A Figura 2 mostra o produto acabado. Permitir que o mouse para recuperar pelo menos 5 dias. Monitor de peso e saúde em geral. Utilizar o regime de pós-operatório adequado analgésico aprovado pelo cuidado da instituição de origem animal eUse Comitê. 3. Hiperinsulinêmico euglicêmico-clamp Rápido o mouse por 5-6h. Como referência, o tempo t = 0 min refere-se ao final do jejum eo início da infusão de insulina e glicose (ou seja, período do grampo). A linha de configuração e tempo para um experimento típico são mostrados na Figura 3. Use tubulação de Micro-Renathane ou equivalente para infusão e linhas de amostragem. Suspender uma giratória dual-channel acima do mouse. Isto serve como um hub entre o mouse ea infusão / amostragem seringas. Durante o experimento, o rato permanece em uma gaiola ou recipiente similar e é preso à peça giratória. Antes de conectar o mouse, preencher a linha de amostragem arterial com solução salina heparinizada (heparina 10 U / ml solução salina) e coloque um conector de aço inoxidável na extremidade inferior da linha. Deixe uma seringa com solução salina heparinizada (clearing seringa) conectado à parte superior da linha de amostragem. Isso será usado para elaborar sangue samples. Preencha a linha de infusão venosa com soro fisiológico heparinizado não a partir da infusão da porta giratória (Segmento A na Figura 3A) todo o caminho até o fundo da linha. Conecte a extremidade superior da linha e colocar um conector de aço inoxidável (ou um conector Y-se um bolus deve ser administrada) na extremidade inferior da linha. Se um traçador isotópico de glicose (por exemplo, [3-3 H] glicose) está sendo infundido, segura uma seringa de 1 ml contendo o marcador para uma seringa de infusão. Preencha a linha de infusão venosa com traçador em vez de soro fisiológico (Figura 3B). Após três horas de jejum, pesar o mouse e conecte o PE-20 para a veia jugular e cateteres arterial para a perfusão e linhas de amostragem, respectivamente. Se a administração [3-3 H] marcador de glicose, iniciar uma infusão preparada traçador contínua em t = -90 min (Figura 3C). Uma dose priming típico é um μCi. Prepare um μCi 0,05 / mL [3-3 H] glicose solution em não heparinizado salina. Carregar a solução em uma seringa de 1 ml e segura a seringa na bomba de infusão. Administrar a dose priming, infundindo 20 l / min por 1 min. Seguir com uma infusão contínua de 0,05 μCi / min (1 ml / min) por um período de equilíbrio 90 min. Prepare infusatos de insulina e glicose. A insulina é preparada em não heparinizado salina contendo plasma 3% como um transportador (uma concentração adequada de BSA também pode ser usado). Infusatos glicose estão comercialmente disponíveis em uma variedade de concentrações (5%, 20 e 50). Prepare-salina lavados infusato erythorocyte pela obtenção de sangue total a partir de um camundongo doador, de preferência da mesma estirpe de fundo como o mouse experimental. Tipicamente de 1 ml de sangue total é necessária por rato estudo. Centrífuga de sangue para eritrócitos separados. Lavar os eritrócitos com soro fisiológico 10 U / ml heparinizado e centrifugar para descartar a solução salina. Determinar o volume de eritrócitos e ressuspender em um volume igual de 10 U / ml heparinized salina. Desenhar cada infusato em uma seringa de 1 ml e seguro para cada seringa uma bomba de infusão individual. Conectar cada seringa para um conector de 4 vias (Figura 3). Em t = -15 min tirar uma amostra de sangue pela lenta elaboração de 5-10 mL de sangue na seringa de compensação. Fixar a linha de amostragem arterial e retire a seringa de compensação. Usando um medidor de glicose de mão, faça uma leitura de glicose no sangue através da remoção do clamp na linha de amostragem arterial e permitindo que o sangue flua para a faixa de medidor de glicose. Uma vez que a medição de glicose é retirado, braçadeira da linha de amostragem arterial e inserir uma seringa com agulha romba (seringa de amostragem) para a linha de amostragem arterial. Retire o grampo e desenhe um volume de sangue (ver nota) para a seringa de amostragem. Fixar a linha de amostragem arterial e retire a seringa de amostragem. Inserir a seringa clearing de volta para a linha de amostragem arterial. Elaborar o êmbolo para remover quaisquer bolhas de ar e re-infundir o5-10 mL de sangue que foi originalmente desenhado. Nota: O volume de amostra de sangue depende da análise que está sendo executada. Por exemplo, a análise de [3-3 H] concentração de glicose requer 10 ml de plasma, de modo 50 ul de sangue são retirados. Isso rende 20-30 mL de plasma, que é suficiente para a análise mais plasma adicionais se necessário. Medições de hormônios e outros metabólitos (por exemplo, insulina, ácidos graxos livres) requerem amostragem de sangue adicional. Dispensar o sangue na seringa de amostragem em um microtubo EDTA. Centrífuga e recolher o plasma. Manter o plasma no gelo até o final do estudo ou imediatamente armazenar a -20 ° C. Repita os passos de 3,10 por 3,12 de t = -5 min. Obtenção de sangue adicional (50 mL) para a medição de níveis basais de insulina plasmática. Medida de hematócrito inicial por coleta de sangue em um tubo de heparina ou EDTA-tratados capilar. As medidas obtidas from amostras de plasma em t = -15 e -5 min representam basal (em jejum, por exemplo) valores. Após a amostra em t = -5 min, preencha as linhas de infusão para eritrócitos glicose, insulina e salino-lavadas até o conector de 4 vias. Ligue o conector de 4 vias para o tubo conectado à porta giratória de infusão (ou o tubo conectado ao conector Y se infundindo [3-3 H] glicose) como mostrado na Figura 3. Começar a infundir os eritrócitos lavados com solução salina em primeiro lugar. Definir a taxa de infusão para substituir o volume total de sangue a ser recolhida durante a duração do estudo (por exemplo, se um total de 500 mL de sangue são recolhidas durante 120 min do estudo, definir a taxa de infusão para 4,2 mL / min). Em contraste com a infusatos outros, a solução de eritrócitos é vermelho. Infundindo esta primeira solução permite que qualquer potencial de resistência ou obstruções nas linhas de infusão para ser identificada e corrigida. Uma vez que o infusato eritrócito chega ao mouse, iniciar a insulina einfusões de glicose. Esta é agora t = 0 min. A insulina é infundida a uma constante, a taxa pré-determinada. Uma taxa de infusão de insulina, de 4 mU • kg -1 • min -1 normalmente suprimir a produção endógena de glicose por 80-100% e estimular o desaparecimento de glicose por 2-3 vezes. A taxa de infusão inicial de glicose (GIR) é estimado com base na linha de base os níveis sanguíneos de glicose e experiência anterior. Se infundindo [3-3 H] glicose, pode-se optar por aumentar a taxa de infusão de traçador para coincidir com o aumento estimado no volume de negócios de glicose (tipicamente um aumento de 2-3 vezes). Considerando a alta taxa de rotatividade de glicose no mouse, amostras de sangue devem ser obtidas a partir da linha arterial pelo menos a cada 10 minutos para a medição da concentração de glicose ao longo da duração do experimento. Ajustar o GIR para atingir e manter euglicemia alvo (Figura 3C). Esta meta pode variar dependendo do modelo ou os objectivos do estudo. Um bom alvo glucose concentração é 150 mg • dL-1 uma vez que este é um nível de glicose em jejum 6h típico para um mouse C57Bl/6J chow-alimentados. O objetivo é conseguir euglicemia rapidamente, de preferência dentro do primeiro min 40-50, e de ter glicose e estável GIR até o início do período de steady-state (t = 80 min). Se infundindo [3-3 H] glicose, obter sangue adicional em t = 80, 90, 100, 110 e 120 min para a medição de plasma [3-3 H] a atividade de glicose específicos. Coleta de sangue adicionais em t = 100 e 120 min para a medição de insulina plasmática e qualquer outro hormônio (s) ou metabólito (s). Em t = 110 min, tirar sangue para um tubo de heparina ou EDTA-tratados capilar para a medição de grampo hematócrito. Após a amostra em t = 120 min é tomado, 2 [14 C] deoxiglicose pode ser administrada para a medição de tecido-específicos a captação de glicose. Administrar um bolus 12 μCi na linha de bolus conectado à linha de amostragem jugular (Figura 3B </strong>). Obter amostras de sangue (50 ul) a partir da linha de amostragem arterial em t = 2, 15, 25 e 35 min após a administração do bolo para a medição de plasma 2 [14 C] deoxiglicose níveis. Após a última amostra, anestesiar o rato com uma infusão de pentobarbital dada diretamente na linha arterial. Rapidamente dissecar todos os tecidos necessários para a avaliação da absorção de glicose (por exemplo, músculos esqueléticos de vários tipos, tecido adiposo, coração, cérebro) e quaisquer outros tecidos (por exemplo, fígado, baço, rins). Snap tecidos congelar em nitrogênio líquido e armazenamento a -80 ° C até serem analisadas. De glicose nos tecidos é analisado através da medição da acumulação de 2 fosforilada [14 C] deoxiglicose nos tecidos congelados e ao desaparecimento de 2 [14 C] deoxiglicose do plasma. 4. Resultados representante Um exemplo dos resultados obtidos com um experimento clamp de insulina é mostrado na Figura 4.Este exemplo mostra a capacidade de uma dieta rica em gordura à resistência à insulina em ratos precipitar. Todas as apresentações de resultados de clamp de insulina deve incluir o seguinte a ser interpretáveis: um curso de tempo dos níveis de glicose no sangue, um curso de tempo do GIR e os níveis de insulina plasmática (linha de base e pinça). Como mostrado aqui, glicose de jejum (Figura 4A) e insulina (Figura 4C), os níveis são mais elevados em ratos alimentados com uma dieta rica em gordura, indicativo de resistência à insulina. Apresentando uma evolução no tempo dos níveis de glicose ao longo do estudo clamp (Figura 4A) permite ao leitor avaliar como euglicemia foi mantida, o que é indicativo da qualidade do grampo. Da mesma forma, um curso de tempo do GIR (Figura 4B) permite que o leitor para determinar quão rapidamente um estado de equilíbrio foi alcançado. Mostrando esses dados como cursos tempo é significativamente mais informativa do que a prática convencional na literatura clamp do mouse insulina de apresentar uma experiência de 2 horascomo um ponto de referência único que representa valores médios de um período de "clamp" indefinido (13/04). No presente exemplo, os níveis de glicose foram iguais entre o controle e alto teor de gordura alimentados grupos, mas o GIR foi significativamente menor no alto teor de gordura alimentados grupo (Figura 4B). Isso é indicativo de uma deficiência em todo o corpo a ação da insulina. Níveis de insulina grampo também foram maiores no alto teor de gordura alimentados grupo (Figura 4C), um maior apoio à presença de um fenótipo de resistência à insulina nesses camundongos. O uso de infusões traçador isotópico permite a avaliação da ação da insulina em tecidos específicos. [3-3 H] glicose é utilizada para estimar a taxa de aparecimento de glicose endógena (Endora), que é um índice da produção hepática de glicose (HGP) ea taxa de desaparecimento de corpo inteiro de glicose (Rd). Enquanto a insulina elimina completamente HGP em ratos controle, esta é prejudicada em ratos alimentados com uma dieta rica em gordura (Figura 4D). Da mesma forma, a capacidade de nossulin para estimular Rd em ratos controle é comprometida em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura (Figura 4E). 2 [14 C] deoxiglicose é usado para avaliar o índice metabólico de glicose (Rg), uma medida de tecido-específicos a captação de glicose. Como pode ser visto neste exemplo, a insulina estimulou-absorção da glicose no músculo esquelético é prejudicada em ratos alimentados com uma dieta rica em gordura (Figura 4F). Figura 1: Preparação da hipertensão arterial (A) e cateteres (B) e venosa (C) MASA tm. Cateteres arteriais são preparados através da inserção de um pedaço de 1,3 centímetros PE-10 cerca de 3 mm em um pedaço seis centímetros de 0,012 silastic ID ". A ponta PE-10 é chanfrado de tal forma que o comprimento do chanfro para o silastic é de 0,9 cm. Venosa cateteres são feitos deslizando um pequeno pedaço de 0,020 "ID silastic 1,1 centímetros a partir do final de uma peça chanfrada 6 centímetros de 0,012" silastic ID. Os 0.020 "ID atos pedaço silastic como um talão de restrição para si curar o cateter na veia jugular. Para montagem do tm MASA, cada um dos dois centímetros 1,3 de calibre 25 conectores é inserido em cada um dos dois pedaços 3 cm de PE-20. Estes são mantidos juntos por um pequeno pedaço de 0,040 silastic ID ". Os conectores são dobradas a um ângulo de 120 ° e separados em um ângulo de 45 °. Todo o conjunto é imerso em adesivo de silicone médico. Figura 2: mouse cateterizada. Cateteres são implantados cirurgicamente na artéria carótida esquerda e da veia jugular direita. As extremidades livres dos cateteres são exteriorizadas por trás da cabeça e conectado a um tm MASA. O tm MASA é inserido por via subcutânea entre as omoplatas. Este permite o acesso vascular durante as experiências clamp de insulina sem a necessidade de controlar, manipular ou anestesiar o mouse. jpg "/> Figura 3: Representação da linha de configuração e tempo para um experimento clamp de insulina. O mouse é preso a um suporte giratório dual-channel que atua como um hub para infusão e seringas de amostragem. Configurações típicas para experimentos não usar infusões marcador (A) e utilizando ambos [3-3 H] glicose e 2 [14 C] deoxiglicose (B) são mostradas. Uma linha do tempo dos procedimentos de criação e realização do clamp de insulina (C) também é mostrado. Durante o clamp, amostras de sangue ( ) São tomadas a cada 10 minutos para medir glicose no sangue. O GIR é ajustada para manter a euglicemia. Amostras para a glicose sanguínea inicial, insulina plasmática e plasma [3-3 H] glicose são tomadas em t = -15 e -5 min. Amostras para grampo plasma [3-3 H] glicose são tomadas em t = 80, 90, 100, 110 e 120 e de insulina no clamp t = 100 e 120 min. 2 [14 C] deoxiglicose é administrado após a amostra em t = 120 min e blood é coletada em t = 2, 15, 25 e 35 min depois. Tecidos são tomadas após a amostra min t = 35. Figura 4: Resultados de um experimento clamp de insulina comparando ratos em uma dieta controle (Chow) para ratos em uma dieta rica em gordura (DFH). Curso de tempo de glicose arterial (A) e insulina GIR (B) de base, e braçadeira (C), Endora (D) e Rd (E) e no músculo esquelético (gastrocnêmio e vasto lateral) Rg (F) são mostradas. Todos os resultados indicam o efeito da alimentação rica em gordura para induzir resistência à insulina.