高インスリン血症 – 正常血糖クランプ、またはインスリンクランプは、インスリンの作用を評価するためのゴールドスタンダードです。<em> in vivoで</em>。マウスではインスリンクランプを行う方法について説明する。これは最小限のストレスで意識、無拘束マウスで実行する実験を許可する動脈カテーテル法のためのメソッドが含まれています。
2型糖尿病はインスリン作用の欠損によって特徴付けられる。高インスリン血症-正常血糖クランプ、またはインスリンクランプは、広く生体内でインスリンの作用を評価するための"ゴールドスタンダード"の方法と考えられている。インスリンクランプ時には、高インスリン血症は、一定のインスリン注入することによって達成される。正常血糖値は、可変レートで併用グルコース注入を介して維持されます。この変数はグルコース注入率(GIR)は、実験を通して短い間隔で血糖値を測定し、それに応じてGIRを調整することによって決定されます。強化インスリン作用を有するマウスは、より大きなGIRを必要とGIRは、全身インスリン作用の指標である。インスリンクランプは同位体2の管理を組み込むことができます[14 C]デオキシグルコースは、組織特異的グルコース取り込みを評価すると[3 – 3 H]グルコースは、内因性のグルコースの外観(endoRa)の速度を抑制するインスリンの能力、のマーカーを評価する肝臓でのグルコース産生、および刺激する全身グルコースの消失(路)の割合。
代謝性疾患の遺伝的マウスモデルで使用するためにインスリンクランプの小型化は、糖尿病の研究に大きな進歩をもたらした。インスリンクランプを実行するためのメソッドは、研究室によって異なります。インスリンクランプが行われる方法が大幅に得られた結果に影響を与えることができることに注意することは重要です。私たちは、意識的なマウス1と同様に様々なクランプ技法2を使用して、4つの一般的に使用される近交系マウスの代謝反応の評価にインスリンクランプを行うためにさまざまなアプローチの包括的な評価を発表している。ここでは、ヴァンダービルトマウス代謝表現型センター(;:www.mc.vanderbilt.edu / MMPC URL MMPC)により開発された意識、無拘束マウスにインスリンクランプを行うためのプロトコルを示す。これは、インスリンクランプ時に使用されるカテーテルを注入するための方法の説明が含まれています。で採用されているプロトコルバンダービルトMMPCは、ユニークな2カテーテルシステム3を利用しています。 Oneカテーテルは、注入のための頸静脈に挿入されます。第二カテーテルは、マウスを抑制または処理することなく、血液サンプリングを可能に頸動脈に挿入されます。このテクニックは、尾の切断端からのサンプリングです。インスリンクランプ時の血液サンプルを得るために最も一般的な方法に重要な利点を提供します。この後者のメソッドとは異なり、動脈カテーテルからサ ンプリングすると、マウス1〜ストレスではありません。我々はまた、組織特異的なインスリン作用を評価するために同位体トレーサーの注入を使用するための方法を説明します。我々はまた、インスリンの留め金から得られた結果の適切なプレゼンテーションのためのガイドラインを提供しています。
高インスリン血症-正常血糖クランプ、またはインスリンクランプは、広く生体内でインスリンの作用を評価するための"ゴールドスタンダード"の方法と考えられている。この手法は、ヒト、イヌ、ラットやマウスを含むいくつかの種に適用されています。代謝性疾患のためのトランスジェニックマウスモデルの増加を考えると、マウスで使用するための技術の微細化は代謝の研究に大きな進歩を提供しています。
インスリンクランプの背後にある概念は単純ですが、実際にインスリンクランプ実験を行うためのさまざまなアプローチがあります。実験が行われる方法は、1を得られた結果に影響しますので、これは、些細な点ではありません。ここでは、ヴァンダービルトMMPCで使用されるプロトコルを提示する。我々のプロトコルや他の人のそれとの間の重要な違いは、我々は血液サンプルを得るために動脈カテーテルを使用することです。これはOBTのより広く使用されているアプローチとは対照的であるテール4、7、11、12、14から17の先端を切断することで血液サンプルをaining。動脈カテーテルからのサンプリングの利点は、実験が意識奔放マウスで実施されていることです。尾からのサンプリングはしばしば拘束を必要とし、大規模な血液サンプルが1を取得しているときにストレスの指標を向上させます。ストレスホルモンは、内因性グルコース産生を刺激し、グルコース処理18、19を損なう、潜在的にインスリン抵抗性の表現型の外観を与える。切断尾からサンプリングするため、そのストレスの多い性質の特殊な動物実験および使用委員会の承認を必要とする場合があります。動脈カテーテル法の手順は、尾を切断のマウスにストレスを回避するために開発されました。
インスリンクランプを行うことの重要な側面は、正常血糖を維持する能力です。正しくGIRは、血糖測定値に基づいて調整されるべきかを予測できるものアルゴリズムがありません。手術のような、インスリンクランプ実験を行う要員は、唯一の経験を通じて合理的な血糖値を維持するのに熟達するでしょう。ために彼らのより高い代謝率のマウスの研究から得られたデータは本質的に雑音になることに注意することは重要です。これは時間のグルコースとGIRのコースと血漿インスリン、endoRa、Rdと結果を解釈するためにあらゆるリーダーの能力のための重要なRgの絶対値を含むデータの完全なプレゼンテーションを、です。マウス(ヒトでの速度よりも約5倍)の高グルコースの流束率はグルコースのサンプリングの高周波数を保証。マウスの血液量が限られている間、一度、10分ごとの最小サンプリング周波数は、適切なクランプが確立されていることを確信する必要があります。
図4に示すように、クランプのインスリンレベルは、グループ間で異なる可能性があります。このような食事の介入、トランスジェニック操作やバックグラウンドの系統の違いなどの要因は、FASに影響を与える可能性がその後、クランプのインスリンレベルに影響を与える可能ティンのインスリンレベル、。クランプのインスリン濃度が異なる場合の結果を解釈するのが問題になる可能性があります。これは、実験群の間に相当するクランプのインスリンレベルを達成するインスリン注入速度を選択するためのパイロット実験を行うことにより対処することができます。また、ソマトスタチンは、膵臓のホルモンの分泌を抑制するために使用することができます、そしてインシュリンとグルカゴンは、実験的に制御するレートで交換することができます。この後者のアプローチは、より一般的にはマウスよりもラットにインスリンクランプで行われます。これらの実験的アプローチが取られていない場合、定常状態のGIRは、クランプインスリンレベルに正規化することができます、またはインスリン感受性指数(S I)は、S I = GIR /(G•ΔI)、などのクランプのデータから導出することができますGは、定常状態のグルコース濃度であり、ΔIは、空腹時やクランプのインスリン濃度との差です。どちらのアプローチで一つの仮定は達成クランプのインスリンレベルがあることです。インスリン感受性が直線的に研究されているグループに応じてインスリンのレベルに関連している範囲内で。インスリン抵抗性とインスリン感受性のグループを比較するときは、この後者の仮定は適用されない場合があります。理想的には、インスリンの用量反応曲線は、適切なインスリン注入を選択するために生成する必要があります。しかし、追加実験の必要性から、これはめったに行われません。
動脈カテーテルが提供する汎用性は、正常血糖クランプを超えた実験的なアプローチにも及ぶ。例えば、高血糖クランプは、グルコースが空腹時血糖値からの相対高血糖を維持するために可変速度で注入されている、 生体 2、20、21 の内因性膵臓機能を評価するために使用することができます。このテスト中に第一段階のインスリン分泌の測定は、血液サンプルの頻繁な買収(毎2〜5分間すなわち)、尾の先端からサンプルを取得するときには不可能ですが必要です。また、尾サンプリングに起因する上昇カテコールアミンがインスリン分泌を障害するとグルカゴンの分泌22を高めることができる。インスリンクランプのプロトコルはまた、反規制への反応2、23、24を評価するために相対的な低血糖に低下する血糖値を可能にするために変更することができます。動脈カテーテルはまた、運動25から30の間にグルコース代謝の動態を評価するために使用することができます。これは、単一の時点の前後の運動時または分離された筋肉を ex vivoで実施された従来の手法よりも著しく有利で ある。ここで紹介するテクニックは、だけでなくグルコースでなく、脂肪酸の代謝31を評価するために使用することができます。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、グラントヴァンダービルトマウスの代謝表現型のセンターに5 – U24 – DK059637 – 10によってサポートされていました。