Yetişkin hayvanlarda yenidoğan dentat granül hücrelerin entegrasyonu çalışma bir şekilde açıklanmıştır. Bu teknik, yeni doğan nöronlar, in vivo işlevsel entegrasyonu belirlemek için elektrofizyolojik kayıtlar takip etiketlemek için tasarlanmış bir retrovirüs kullanır.
Nöron lateral ventrikülün alt-ventriküler zon (SVZ) ve hayatı boyunca hipokampal dentat girus alt granüler bölgesi (SGZ) yetişkin memelilerin beyinlerinde oluşur. Önceki raporlar, epilepsi, şizofreni, depresyon ve anksiyete (1) de dahil olmak üzere çeşitli beyin bozuklukları, yetişkin hipokampal nöron ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Normal ve anormal yetişkin doğumlu nöron entegrasyon süreci Deşifre bu hastalıkların etyolojisi ışık tutacak ve yeni tedavilerin geliştirilmesi bilgilendirebilir.
SGZ yetişkin nöron kaderi şartname, göç, sinaptik bütünleşme ve olgunlaşma aşamaları da dahil olmak üzere, embriyonik ve post-natal nöronal gelişim aynalar. Ancak, tam entegrasyon, 6 haftalık uzun bir süre içinde oluşur. İlk sinaptik giriş yetişkin doğumlu SGZ dentat granül hücreleri (KEGM), 14 gün (2) glutamaterjik girişi takiben, GABAerjik . Dentat girus yetişkin doğumlu nöronların devre oluşumunu düzenleyen özgü faktörler henüz bilinmemektedir.
Laboratuvarımız bu hızla çoğalan hücreleri floresan proteinleri ve hipotez düzenleyici genler teslim Moloney fare lösemi virüsü dayalı bir çoğaltma eksikliği retroviral vektör kullanır. Bu viral teknik hücre doğum tarihini, soy, morfoloji ve sinaptogenez analizi için yüksek özgüllük ve çözünürlük sağlar.
Tipik bir deney, genellikle benzersiz bir etiket, transgen, ve in vivo olarak istenen bir gelişim sürecinin tek hücreli analiz için organizatörü unsurları içeren iki ya da üç virüsler kullanmaktadır. Aşağıdaki protokol fonksiyonel yeni doğan nöron entegrasyonu tek bir yeşil (GFP) veya kırmızı (dTomato) floresan proteini retrovirüs ve yama klemp elektrofizyoloji kullanarak analiz etmek için bir yöntem açıklanır.
Yetişkin memelilerin beyinlerinin hippocampus bölgesinde Sürekli nöron olgun beyindeki nöronal gelişim ve entegrasyon çalışmak için benzersiz bir deneysel model sistemi sağlar. Burada sunulan protokol retroviral etiketleme ve elektrofizyolojik yöntemler, yetişkin farelerin beyinlerinde yenidoğan dentat granül nöronların entegrasyonu çalışma birleştirir.
Deneylerde başarılı olmasını sağlamak için, prosedürün kritik adımlar sırasında aşağıdaki öneriyor:
Istenmeyen enfeksiyon ve inflamasyon önlemek için ameliyat öncesi tüm araçlar (otoklav, sterilizatör herhangi bir tür veya% 70 etanol) sterilize edilmelidir. Enjeksiyondan önce şırınga iğne ucu steril PBS yıkamak için kullanın.
Virüs enjeksiyon için, hayvanların iyi stereotaksik cihaz monte edilmesi gerekir ve enjeksiyon sırasında gereksiz hareketinin kaynakları minimize edilmelidir. Kafası iyi sabit ve sağlam olduğundan emin olun ve seviyesi bregma ve lambda hesaplanırken enjeksiyon koordinatları önce burun farenin konumunu ayarlamak. Oda sıcaklığında maruz kalma en aza indirmek için virüs hızla şırıngaya Extract – retrovirüsler özellikle ısıya duyarlı. Basınç hasarı en aza indirmek için tavsiye edilen oranda yavaş virüs enjekte edilir. Önerilen düz uçlu bir enjektör (vs ortak Eğimli ucu) eşit olarak dağıtılmış bir dentat girus enfeksiyon alan sağlayacaktır.
Hazırlamadan önce dilim, çözüm kesme ve ACSF kuluçka oksijen çözümleri doyurmak için izin vermek için en az 30 dakika süreyle% 95 O 2 -5% CO 2 ile kabarmış olmalıdır . Hayvanlar hızla perfüze ve doku soğuk, en iyi dilim kalitesi için oksijen doymuş çözüm sağlanmalıdır.
Postsinaptik bir yanıt gelene kadar kayıt için, yavaş yavaş uyaran yoğunluğunu artırır. Dentat girus moleküler katman içinde gerektiğinde uyarı elektrot yerini değiştirin.
Özet olarak, önerilen yaklaşım, aktif, olgun devresi içine erken evre entegrasyonu sırasında farklı özellikleri ve yetişkin doğumlu nöronların olası fonksiyonel rolleri keşfetmek için bir yol sunar.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NINDS ve S.Ge. Amerikan Kalp Derneği tarafından finanse edildi Bu yaklaşım başlangıçta Johns Hopkins Üniversitesi'nden Dr. Hongjun Song laboratuvarda yazar tarafından kurulmuş ve geliştirilmiştir. Dr Hongjun Song Biz onun rehberlik ve destek için teşekkür etmek istiyorum.