تم وصف طريقة لدراسة التكامل بين حديثي الولادة الخلايا الحبيبية المسنن لدى الحيوانات البالغة. هذا الأسلوب يستخدم الارتجاعي هندستها لتسمية المولود الجديد الخلايا العصبية ، تليها التسجيلات الكهربية لتحديد التكامل الوظيفي في الجسم الحي.
تكوين الخلايا العصبية في أدمغة الثدييات يحدث الكبار في منطقة البطين الفرعي (SVZ) من البطين الجانبي وفي منطقة الحبيبية الفرعي (SGZ) من التلفيف المسنن لقرن آمون في جميع مراحل الحياة. وأظهرت تقارير سابقة بأن يرتبط تكوين الخلايا العصبية قرن آمون في الدماغ الكبار الذين يعانون من اضطرابات متنوعة ، بما في ذلك ، والصرع والاكتئاب ، والفصام والقلق (1). قد فك رموز عملية طبيعية وشاذة التكامل عصبون البالغين المولودين في تسليط الضوء على مسببات هذه الأمراض وأبلغ تطوير علاجات جديدة.
SGZ تكوين الخلايا العصبية الكبار المرايا التنمية العصبية الجنينية وبعدها ، بما في ذلك مراحل مواصفات مصير ، والهجرة ، والتكامل متشابك ، والنضج. ومع ذلك ، الاندماج الكامل يحدث على مدى فترة طويلة 6 أسابيع. مدخلات متشابك الأولي إلى البالغين المولودين في الخلايا الحبيبية SGZ المسنن (DGCS) هو GABAergic ، تليها مدخلات glutamatergic في 14 يوما (2). العوامل المحددة التي تنظم تشكيل الدائرة من البالغين المولودين في الخلايا العصبية في التلفيف المسنن غير معروف حاليا.
مختبرنا يستخدم النسخ المتماثل التي تعاني من نقص ناقلات فيروسات استنادا إلى فيروس اللوكيميا مولوني الفئران لتوصيل الجينات البروتينات الفلورية والتنظيمية المفترضة لهذه الخلايا المتكاثرة. هذا الأسلوب يوفر الفيروسية خصوصية عالية ودقة لتحليل تاريخ ميلاد الخلية ، والنسب ، مورفولوجيا ، وsynaptogenesis.
تجربة نموذجية غالبا ما توظف اثنين أو ثلاثة من الفيروسات التي تحتوي على تسمية فريدة من نوعها ، التحوير ، ومروج لعناصر وحيدة الخلية تحليل العملية التنموية المنشودة في الجسم الحي. بروتوكول التالية توضح طريقة لتحليل الخلايا العصبية الوظيفية التكامل الوليد به خضراء واحدة (GFP) أو أحمر (dTomato) الارتجاعي بروتين فلوري والتصحيح ، المشبك الكهربية.
تكوين الخلايا العصبية في قرن آمون المستمر للأدمغة الثدييات الكبار ويوفر نظام فريد النموذج التجريبي لدراسة التنمية والتكامل في الخلايا العصبية للدماغ ناضجة. بروتوكول المعروضة هنا يجمع العلامات فيروسات وطرق الكهربية لدراسة التكامل بين الخلايا العصبية الوليد الحبيبية المسنن في أدمغة فئران بالغة.
لضمان تجاربك الناجحة ، فإننا نوصي بما يلي خلال الخطوات الحاسمة من الإجراء :
لتجنب العدوى والالتهابات غير المرغوب فيها ، يجب تعقيم جميع الأدوات (عن طريق التعقيم ، أي نوع من التعقيم ، أو الايثانول 70 ٪) قبل الجراحة. استخدام برنامج تلفزيوني العقيمة لغسل رأس الإبرة حقنة قبل الحقن.
للحقن الفيروس ، يجب أن تكون محمولة على الحيوانات بشكل جيد على الجهاز التجسيمي ويجب التقليل من مصادر حركة لا لزوم لها خلال الحقن. تأكد من أن الرأس هو ثابت وراسخ جيدا ، وضبط موضع أنفه من الماوس لbregma مستوى وامدا قبل حساب إحداثيات الحقن. استخراج الفيروس إلى المحقنة بسرعة للحد من التعرض لدرجة حرارة الغرفة — الفيروسات القهقرية بشكل خاص حساس للحرارة. حقن الفيروس ببطء بمعدل أوصت للحد من الأضرار الضغط. وأوصى باستخدام حقنة ذات الرؤوس المسطحة (مقابل طرف مشطوف شيوعا) ضمان وجود عدوى موزعة بالتساوي منطقة التلفيف المسنن.
قبل إعداد شرائح ، لا بد من قطع فقاعات الحل ويحتضنها ACSF مع 95 ٪ O CO 2 -5 2 ٪ على الأقل 30 دقيقة للسماح للتشبع الأكسجين إلى الحلول. وينبغي perfused الحيوانات بسرعة والمحافظة على النسيج في البرد حل الأكسجين المشبعة ، للحصول على جودة أفضل شريحة.
للتسجيل ، وزيادة كثافة التحفيز تدريجيا حتى هناك استجابة بعد المشبكي. تغير موقع القطب التحفيز داخل الطبقة الجزيئية للالتلفيف المسنن عند الضرورة.
وباختصار ، فإن النهج الموصى به يوفر وسيلة لاستكشاف خصائص متميزة وأدوار وظيفية ممكنة من البالغين المولودين في الخلايا العصبية في المرحلة الأولى من الاندماج في الدوائر ونشطة ناضجة.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل NINDS وجمعية القلب الأميركية إلى S.Ge. تأسست أصلا هذا النهج ، والتي وضعها المؤلف في مختبر الدكتور سونغ هونغ جون في جامعة جونز هوبكنز. نود أن نشكر الدكتور سونغ هونغ جون لتوجيهاته ودعمه.