Een manier om de integratie van de pasgeborene dentate granule cellen studie bij volwassen dieren is beschreven. Deze techniek maakt gebruik van een retrovirus ontworpen voor pasgeboren neuronen, gevolgd door elektrofysiologische opnames om te bepalen in vivo functionele integratie label.
Neurogenese voorkomt bij volwassen zoogdieren hersenen in de sub-ventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikel en in de sub-korrelige zone (SGZ) van de hippocampus dentate gyrus gedurende het hele leven. Eerdere rapporten is gebleken dat volwassen hippocampus neurogenese wordt in verband gebracht met diverse hersenaandoeningen, zoals epilepsie, schizofrenie, depressie en angst (1). Ontcijfering van het proces van normale en afwijkende volwassenen geboren neuron integratie kan licht werpen op het ontstaan van deze ziekten en de hoogte van de ontwikkeling van nieuwe therapieën.
SGZ volwassen neurogenese spiegels embryonale en postnatale neuronale ontwikkeling, met inbegrip stadia van het lot specificatie, migratie, synaptische integratie en rijping. De volledige integratie gebeurt over een langere, periode van 6 weken. Eerste synaptische input voor volwassenen geboren SGZ dentate granule cellen (DGCs) is GABA-erge, gevolgd door glutamaat input op 14 dagen (2). De specifieke factoren die de vorming van volwassen circuit geboren neuronen in de dentate gyrus regelen zijn op dit moment onbekend.
Ons laboratorium maakt gebruik van een replicatie-deficiënte retrovirale vector gebaseerd op het Moloney murine leukemie virus naar fluorescerende eiwitten en veronderstelden regulerende genen te leveren aan deze prolifererende cellen. Deze virale techniek zorgt voor een hoge specificiteit en resolutie voor de analyse van cel geboortedatum, geslacht, morfologie, en synaptogenese.
Een typisch experiment maakt gebruik van vaak twee of drie virussen met uniek label, transgene en promotor elementen voor single-cell analyse van een gewenste ontwikkelingsproces in vivo. Het volgende protocol beschrijft een methode voor het analyseren van functionele pasgeboren neuron-integratie met een enkele groen (GFP) of rood (dTomato) fluorescent eiwit retrovirus en patch-clamp elektrofysiologie.
Continu neurogenese in de hippocampus van volwassen zoogdieren hersenen biedt een uniek experimenteel model systeem om neuronale ontwikkeling en integratie in de volwassen hersenen te bestuderen. Het protocol hier gepresenteerde combinatie van retrovirale etikettering en de elektrofysiologische methoden om de integratie van de pasgeborene dentate granule neuronen in de hersenen van volwassen muizen te bestuderen.
Om ervoor te zorgen dat uw experimenten succesvol zijn, raden wij de volgende tijdens kritieke fasen van de procedure:
Om te voorkomen dat ongewenste infectie en ontsteking, moeten alle gereedschappen gesteriliseerd worden (de autoclaaf, elk type sterilisator, of 70% ethanol) voor de operatie. Gebruik steriel PBS tot de punt van de naald te wassen voor injectie.
Voor virus injectie moeten de dieren goed worden gemonteerd op de stereotaxische apparaat en bronnen van onnodige beweging moet worden geminimaliseerd tijdens de injectie. Zorg ervoor dat het hoofd goed vast en stevig, en pas de neus positie van de muis naar niveau bregma en lambda voorafgaand aan de berekening van de injectie coördinaten. Extract virus in de spuit snel naar de blootstelling aan kamertemperatuur te minimaliseren – retrovirussen zijn bijzonder temperatuur gevoelig. Injecteer langzaam virus bij de aanbevolen snelheid om de druk schade te minimaliseren. Met behulp van de aanbevolen platte spuit (vs. gemeenschappelijke afgeschuinde tip) zal zorgen voor een gelijkmatige verdeling van dentate gyrus infectie gebied.
Alvorens plakken, moet snijden oplossing en incuberen ACSF te borrelen met 95% O 2 -5% CO 2 gedurende tenminste 30 minuten om zuurstof aan de oplossingen te verzadigen. De dieren moeten snel worden geperfundeerd en weefsel onderhouden in koude, zuurstof-verzadigde oplossing voor de beste slice kwaliteit.
Voor het opnemen, geleidelijk verhogen van de stimulus intensiteit totdat er een postsynaptische antwoord. Verander de locatie van de stimulatie-elektrode in de moleculaire laag van de dentate gyrus als nodig is.
Kortom, de aanbevolen aanpak biedt een manier om de verschillende eigenschappen en mogelijke functionele rol van de volwassen geboren neuronen ontdekken tijdens een vroeg stadium integratie in de actieve, volwassen circuit.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door NINDS en American Heart Association S.Ge. Deze aanpak was oorspronkelijk opgericht en ontwikkeld door de auteur in het laboratorium van Dr Hongjun Song's in het Johns Hopkins University. We willen graag Dr Hongjun Song bedanken voor zijn begeleiding en ondersteuning.