הדרך ללמוד את השילוב של היילוד תאים גרגר משוננת בבעלי חיים מבוגרים מתואר. טכניקה זו משתמשת רטרווירוס מהונדסים תווית נוירונים היילוד, ואחריו הקלטות אלקטרו לקבוע אינטגרציה תפקודית vivo.
Neurogenesis מתרחש במוחם של יונקים בוגרים באזור חדרית המשנה (SVZ) של החדר לרוחב באזור תת פרטנית (SGZ) של gyrus משוננת בהיפוקמפוס לאורך כל החיים. דיווחים קודמים הראו כי neurogenesis בהיפוקמפוס מבוגר קשורה בהפרעות מוח שונים, כולל דיכאון, אפילפסיה, סכיזופרניה וחרדה (1). פענוח תהליך של שילוב בוגרים שנולדו נורמלי סוטה נוירון עשוי לשפוך אור על האטיולוגיה של מחלות אלו ולהודיע פיתוח טיפולים חדשים.
Neurogenesis SGZ מבוגר מראות התפתחות עובריים עצביים שלאחר הלידה, כולל שלבי מפרט הגורל, הגירה, אינטגרציה סינפטית, והתבגרות. עם זאת, אינטגרציה מלאה מתרחשת על פני תקופה ארוכה 6 שבועות,. הקלט הסינפטי הראשונית מבוגר יליד תאים SGZ גרגיר משוננת (DGCs) הוא GABAergic, ואחריו קלט glutamatergic ב 14 ימים (2). גורמים ספציפיים המווסתים את היווצרות מעגל של מבוגר יליד נוירונים gyrus משוננת כרגע לא ידוע.
המעבדה שלנו משתמשת שכפול מחסר וקטור retroviral מבוסס על נגיף Moloney Murine לוקמיה לספק חלבונים פלורסנט גנים רגולטוריים שיערו תאים אלה מתרבים. טכניקה זו מספקת סגוליות ויראלי ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח של תאריך הלידה התא, שושלת, מורפולוגיה, ו synaptogenesis.
ניסוי טיפוסי לעתים קרובות מעסיקה שניים או שלושה וירוסים המכיל תווית ייחודית, transgene, ואלמנטים האמרגן לניתוח תא בודד של תהליך התפתחותי הרצוי in vivo. פרוטוקול הבאה מתארת שיטה לניתוח נוירון תפקודית שילוב היילוד באמצעות ירוק אחד (GFP) או אדום (dTomato) רטרווירוס חלבון פלואורסצנטי ו-clamp תיקון electrophysiology.
Neurogenesis רציף בהיפוקמפוס של מוח היונקים מבוגר מספקת מערכת ייחודית במודל ניסיוני ללמוד פיתוח ואינטגרציה עצב במוח הבוגר. הפרוטוקול המובא כאן משלב תיוג retroviral ושיטות אלקטרו ללמוד את השילוב של היילוד נוירונים גרגיר משוננת במוחם של עכברים בוגרים.
על מנת להבטיח כי הניסויים שלך מצליחים, אנו ממליצים הבאים במהלך השלבים הקריטיים של ההליך:
כדי למנוע זיהום דלקת לא רצויים, כל הכלים צריכים להיות מעוקרים (על ידי מעוקר, כל סוג של מעקר, או אתנול 70%) לפני הניתוח. השתמש PBS סטרילית כדי לשטוף את קצה מחט המזרק לפני ההזרקה.
עבור זריקה וירוס, בעלי חיים חייב להיות מותקן גם על המכשיר stereotaxic ומקורות תנועה מיותרת חייב להיות ממוזער במהלך ההזרקה. ודא הראש מקובע היטב במשרד, ולהתאים את המיקום האף של העכבר לרמה גבחת ו למבדה לפני הזריקה חישוב קואורדינטות. תמצית וירוס לתוך המזרק במהירות כדי לצמצם את החשיפה לטמפרטורות החדר – הטמפרטורה רטרווירוסים הם רגישים במיוחד. הזרק וירוס לאט בקצב מומלץ למזער את הנזק הלחץ. שימוש מומלץ שקצהו שטוח מזרק (לעומת קצה משופעים משותף) יבטיח שטח מופץ באופן שווה משוננת זיהום gyrus.
לפני הכנת פרוסות, חיתוך פתרון דוגרים ACSF חייב להיות מבעבע עם 95% O 2 CO 2 -5% במשך 30 דקות לפחות, כדי לאפשר לחמצן כדי להרוות את הפתרונות. בעלי חיים צריכים להיות perfused במהירות רקמת נשמר בתמיסה קר חמצן רווי, איכות פרוסה הטוב ביותר.
עבור הקלטה, להגביר את עוצמת הגירוי בהדרגה עד אין תגובה postsynaptic. שינוי מיקום האלקטרודה גירוי בתוך השכבה המולקולרית של gyrus משוננת לפי הצורך.
לסיכום, הגישה המומלצת מציעה דרך לחקור תכונות שונות ותפקידים תפקודית אפשרית של מבוגר יליד נוירונים במהלך האינטגרציה בשלב מוקדם לתוך המעגלים, פעיל בוגרת.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי NINDS ו איגוד הלב האמריקני כדי S.Ge. גישה זו הוקם ופותח על ידי המחבר במעבדה של ד"ר Hongjun שיר של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס. ברצוננו להודות שיר ד"ר Hongjun הדרכה ותמיכה שלו.