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Neuroscience

Generación y cocultivo de microglía primaria murina y neuronas corticales

Published: July 26, 2024
doi:
10.3791/67078
, ,
1Department of Biochemistry, Microbiology & Immunology,University of Saskatchewan

Summary

Este protocolo describe un cocultivo microglía-neuronal establecido a partir de células neuronales primarias aisladas de embriones de ratón en los días embrionarios 15-16 y microglía primaria generada a partir de los cerebros de ratones neonatos en los días postnatales 1-2.

Abstract

Las microglías son macrófagos residentes en los tejidos del sistema nervioso central (SNC), que realizan numerosas funciones que apoyan la salud neuronal y la homeostasis del SNC. Son una población importante de células inmunitarias asociadas con la actividad de la enfermedad del SNC, que adoptan fenotipos reactivos que potencialmente contribuyen a la lesión neuronal durante enfermedades neurodegenerativas crónicas como la esclerosis múltiple (EM). Los distintos mecanismos por los cuales la microglía regula la función neuronal y la supervivencia durante la salud y la enfermedad siguen siendo limitados debido a los desafíos para resolver las complejas interacciones in vivo entre la microglía, las neuronas y otros factores ambientales del SNC. Por lo tanto, el enfoque in vitro de co-cultivo de microglía y neuronas sigue siendo una herramienta valiosa para estudiar las interacciones microglía-neurona. Aquí, presentamos un protocolo para generar y co-cultivar microglía primaria y neuronas a partir de ratones. Específicamente, se aislaron microglía después de 9-10 días in vitro a partir de un cultivo de glía mixta establecido a partir de homogeneizados cerebrales derivados de ratones neonatos entre los días postnatales 0-2. Las células neuronales se aislaron de las cortezas cerebrales de embriones de ratón entre los días embrionarios 16-18. Después de 4-5 días in vitro, las células neuronales se sembraron en placas de 96 pocillos, seguidas de la adición de microglía para formar el cocultivo. El tiempo cuidadoso es crítico para este protocolo, ya que ambos tipos de células deben alcanzar la madurez experimental para establecer el cocultivo. En general, este cocultivo puede ser útil para estudiar las interacciones entre la microglía y las neuronas y puede proporcionar múltiples lecturas, incluida la microscopía de inmunofluorescencia, imágenes en vivo, así como ensayos de ARN y proteínas.

Introduction

Las microglías son macrófagos residentes en los tejidos que facilitan la inmunovigilancia y la homeostasis en el sistema nervioso central (SNC)1,2,3. Se originan a partir de células progenitoras eritromieloides del saco vitelino que colonizan el cerebro durante el desarrollo embrionario 4,5,6 y se mantienen a lo largo de la vida del organismo a través de la autorrenovación, que implica proliferación y apoptosis7. En estado estacionario, la microglía en reposo tiene una morfología ramificada y realiza vigilancia tisular 8,9,10.

La microglía expresa numerosos receptores en la superficie celular, lo que les permite responder rápidamente a los cambios en el SNC11,12 y promover respuestas inflamatorias en caso de infecciones o lesiones tisulares 12,13,14, así como durante enfermedades neurodegenerativas 9,15, como la esclerosis múltiple (EM)16,17. La microglía también expresa receptores a varios neurotransmisores y neuropéptidos 18,19,20, lo que sugiere que también pueden responder y regular la actividad neuronal 21,22. De hecho, la microglía y las neuronas interactúan en diversas formas de comunicación bidireccional 8,23 como las interacciones directas mediadas por proteínas de membrana o las interacciones indirectas a través de factores solubles o células intermedias23,24.

Por ejemplo, varios neurotransmisores secretados por las neuronas pueden modular la actividad neuroprotectora o inflamatoria de la microglía 25,26,27. Además, las interacciones directas entre las neuronas y la microglía ayudan a mantener la microglía en un estado homeostático28. Por el contrario, las interacciones directas de la microglía con las neuronas pueden dar forma a los circuitos neuronales29 e influir en la señalización neuronal 30,31,32. Dado que las interrupciones de estas interacciones inducen hiperexcitabilidad de las neuronas30 y reactividad de la microglía33,34, las interacciones microglía-neuronas desreguladas están implicadas como un factor contribuyente a las enfermedades neurológicas33,35. De hecho, se ha descrito que las enfermedades psicóticas23,26 y neurodegenerativas presentan interacciones disfuncionales entre la microglía y las neuronas33. Si bien estas observaciones resaltan la importancia de la comunicación microglía-neurona en el SNC, los mecanismos específicos de cómo estas interacciones regulan las funciones microgliales y neuronales en la salud y la enfermedad son relativamente desconocidos.

Dentro de un entorno complejo como el SNC, múltiples factores ambientales pueden influir en las interacciones microglía-neurona, lo que limita la capacidad de estudiar las interacciones celulares transitorias in vivo. Aquí, presentamos un sistema de cocultivo in vitro de microglía-neurona que se puede utilizar para estudiar las interacciones celulares directas entre la microglía y las neuronas. Este protocolo describe la generación de microglía primaria y neuronas a partir de las cortezas de ratones neonatos entre los días postnatales 0-2 y los días 16-18 de ratones embrionarios, respectivamente. A continuación, las neuronas y la microglía se cultivan conjuntamente en placas de 96 pocillos para realizar experimentos posteriores de alto rendimiento. Anteriormente utilizamos este enfoque para demostrar que la fagocitosis de la microglía protege a las neuronas de la muerte celular mediada por fosfatidilcolina oxidada37, lo que sugiere que este método puede ayudar a comprender las funciones de la microglía en el contexto de la neurodegeneración y la EM. Del mismo modo, los cocultivos microglía-neuronal también pueden ser útiles para investigar el impacto de la diafonía microglía-neurona en otros contextos, como las infecciones virales38 o las lesiones y reparaciones neuronales39. En general, los sistemas de cocultivo in vitro microglía-neurona permiten a los investigadores estudiar las interacciones microglía-neurona en un entorno manipulable y controlado, que complementa los modelos in vivo.

Protocol

Todos los animales utilizados en este estudio fueron alojados y manejados con la aprobación del Comité Universitario de Cuidado de Animales (UACC) de la Universidad de Saskatchewan y el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCAC). Para este estudio se utilizaron ratones macho y hembra CD1 de los días postnatales 0-2 y embriones de los días 16-18 (E16-18) de ratones CD1 preñados. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales</s…

Representative Results

En la Figura 1A se muestra un diagrama de flujo que muestra los pasos clave del cultivo de glía mixta para microglía. En general, se esperan células dispersas y desechos celulares excesivos en el día 1 (Figura 1B). Para el día 4, se debe observar un aumento en el número de células, especialmente con la generación de astrocitos adherentes, como lo indica su morfología alargada (Figura 1C). S…

Discussion

Este artículo describe un protocolo para aislar y cultivar neuronas primarias y microglía primaria de ratón, que posteriormente se utilizan para establecer un cocultivo microglía-neurona que se puede utilizar para estudiar cómo las interacciones de la microglía y las neuronas regulan su salud y función celular. Este enfoque relativamente simple y accesible puede proporcionar información crítica sobre los mecanismos y los resultados funcionales de las interacciones de las neurona…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JP agradece el apoyo financiero del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá y la Facultad de Medicina de la Universidad de Saskatchewan. YD agradece el apoyo financiero del Fondo de Inversión de la Facultad de Medicina de la Universidad de Saskatchewan, la Subvención de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (RGPIN-2023-03659), la Subvención Catalyst de MS Canada (1019973), la Subvención de Establecimiento de la Fundación de Investigación en Salud de Saskatchewan (6368) y la Subvención de Investigación del Cerebro de Futuros Líderes en el Cerebro Canadiense de la Fundación Brain Canada. Las figuras 1A, 2A y 3A se crearon con BioRender.com.

Materials

10 cm Petri dish  Fisher  07-202-011 Sterile
1x Versene Gibco 15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System  Gibco  A3653401
Dissection microscope VWR
DNase I Roche 11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Fetal Bovine Serum  ThermoFisher Sci 12483-020
HBSS (10x) Gibco 14065-056
Hemacytometer Hausser Scientific 1475
HEPES  ThermoFisher Sci 15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Fisher Scientific  21083027
Macrophage colony stimulating factor  Peprotech 315-02
Micro-Forceps RWD F11020-11 Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids Cytiva SH3023801
PBS (10x) ThermoFisher Sci AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x) Gibco 103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide  Sigma P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
Spring scissors RWD S11008-42 Autoclaved/Sterile
Surgical blade Feather 08-916-5D Sterile
T-25 flasks Fisher 10-126-9
T-75 flasks  Fisher 13-680-65
Tissue forceps Codman 30-4218 Autoclaved/Sterile
Tissue scissors RWD S12052-10 Autoclaved/Sterile
Trypan Blue  Thermofisher Sci  15250-061
Trypsin (2.5%) ThermoFisher Sci 15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope Zeiss
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References

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Park, J., Yu, R., Dong, Y. Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (209), e67078, doi:10.3791/67078 (2024).
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